专利名称：一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因型的检测，具体讲，涉及一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒。
背景技术：
白血病(Leukemia)是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞发生恶性增殖，并浸润体内各组织脏器，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。白血病临床上常以发热、出血、贫血，肝、脾、淋巴结肿大为特点。白血病一般按自然病程和细胞发育程度可分为急性白血病(AL)和慢性白血病(CL)，根据白血病细胞的形态和生化特征，又可分为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒-单核细胞白血病(CMML)等。 白血病是国内十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为2. 76/10万人口，我国估计有5万以上患者，且白血病患者的数量正逐年增加。白血病的发病率虽然在肿瘤发病率中排第6位，但在儿童和青少年恶性肿瘤的发病率和死亡率中均占第I位。近年临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色体畸变，如易位、缺失、插入等。这些染色体易位畸变时大部分情况下会产生新的融合基因，这些融合基因可作为用于诊断不同类型白血病和淋巴瘤的分子标志。不同类型的白血病化疗和放疗的方案是不同的。所以，对这些分子标记进行检测分析有利于治疗方案的确定和分析预后。因此，世界卫生组织2000年发布的白血病和淋巴瘤诊断标准已将染色体易位后融合基因检测作为最重要的指标之一。BCR-ABL融合基因表达是各类白血病中研究的最为深入的部分，BCR-ABL和费城(Ph)染色体的形成相关，是白血病中最常见的染色体异常。约90%-95%的CML患者中可检测到这种Ph染色体。Ph染色体形成的分子基础是9号染色体上的c-abl基因易位到22号染色体上的bcr基因上形成BCR-ABL融合基因，即t (9 ；22) (q34 ；qll)易位。临床上把检测Ph染色体作为CML分型诊断依据、疗效评价，以及微小残留病的检测和预后评估的可靠指标。另外，值得一提的是，在CML中，还有一部分的Ph染色体阴性的CML患者，其BCR-ABL融合基因也为阳性，这可能是一部分的Ph染色体不易看清楚，据统计，在CML病人中，BCR-ABL融合基因的阳性率为99%，这也说明分子水平的检测较细胞遗传学的方法更为敏感。此外，在急性淋巴细胞性白血病中，也存在着t (9 ；22) (q34 ；qll)易位，形成BCR-ABL融合基因。t(15 ;17) (q22 ;ql2_21)易位见于 10 %-15 % 的 ANLL 中，可见于 90 % 以上的 APL中，成为APL的一个特异标志，易位产生PML-RARa融合基因。PML基因(早幼粒细胞白血病基因)位于15号染色体，全长50kb，其不同的结构域由不同的外显子编码，外显子I编码脯氨酸激活区，外显子2编码锌指结构，外显子3编码与二聚体化相关的螺旋结构，外显子4-6编码a螺旋区。PML-RARa融合基因可以作为监测白血病微小残留状态的分子指标，对其进行检测有助于进一步了解白血病患者缓解后体内白血病细胞的动力学特性，获得一个从分子水平确定的完全缓解的新标准，从而能够对临床治疗反应作出正确评价，及时调整治疗方案，减轻患者的经济负担，同时减少不必要的化疗所造成的痛苦。t(8 ；21) (q22 ；q22)是AM中最常见的染色体易位，发生率可高达20%-40%，90%见于M2b型白血病中，易位导致AMLl-ETO融合基因的产生。AMLl-ETO融合基因阳性是预后良好的标志，其完全缓解(CR)率可达90%，5年长期无病生存可达50%-70%。采用染色体核型分析结果检测该融合基因有时会得到矛盾的结果，对其进行荧光定量检测可以对病人的病情进行分级，从而进行更为准确的预后判断和复发检测。目前对白血病的检查主要有，血象检查，骨髓涂片检查，血液生化检查等,但这些都没有对融合基因进行检查，获得的结果误差范围也比较大。目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交技术(FISH)，PCR和基因芯片等。但这些方法存在着准确性差、操作复杂等缺陷，临床应用困难。
为了帮助临床医生们准确及时检测白血病融合基因、辅助确定相关化疗方案及复发检测，本发明从中国国情出发，开发了白血病相关融合基因检测试剂盒，该试剂盒能定性检测人骨髓标本中的白血病相关融合基因中BCR-ABL、AMLl-ETO和PML-RARa的RNA量，从而指导白血病临床诊断和用药。
发明内容
本发明涉及一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、试剂盒。为了完成本发明的目的，采用的技术方案为本发明涉及一种检测白血病相关融合基因的引物和探针，其中，所述引物和探针的核苷酸序列为(I)用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针为由SEQ ID NO 1所示的上游引物F1，由SEQ ID NO 2所示的上游引物F2，由SEQ ID NO 3所示的上游引物F3，由SEQ IDNO :4所示的下游引物，由SEQ ID NO :5所示的探针，其中SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列的5’端有Fam标记,3’端有Tamara标记；(2)用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针为由SEQ ID NO :6所示的上游引物F1，由SEQ ID NO 7所示的上游引物F2，由SEQ ID NO 8所示的上游引物F3，由SEQ IDNO :9所示的下游引物，由SEQ ID NO :10所示的探针，其中SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列的5’端有Fam标记,3’端有Tamara标记；(3)用于检测AMLl-ETO融合基因的引物和探针为由SEQ ID NO 11所示的上游引物Fl^SEQ ID NO :12所示的下游引物，由SEQ ID NO : 13所示的探针，其中SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列的5’端有Fam标记,3’端有Tamara标记。本发明还涉及一种检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，所述的试剂盒的组成为所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、对照品和参考品，其中，所述的核酸扩增试剂包括表I :
权利要求
1.一种检测白血病相关融合基因的引物和探针，其中，所述引物和探针的核苷酸序列为 (1)用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针为由SEQID NO 1所示的上游引物F1，由SEQ ID NO 2所示的上游引物F2，由SEQ ID NO 3所示的上游引物F3，由SEQ ID NO 4所示的下游引物，由SEQ ID NO :5所示的探针，其中SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列的5’端有Fam标记,3’端有Tamara标记； (2)用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针为由SEQID NO 6所示的上游引物F1，由SEQ ID NO :7所示的上游引物F2，由SEQ ID NO :8所示的上游引物F3，由SEQ ID NO:9所示的下游引物，由SEQ ID NO: 10所示的探针，其中SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列的5’端有Fam标记,3’端有Tamara标记； (3)用于检测AMLl-ETO融合基因的引物和探针为由SEQID NO 11所示的上游引物F1，由SEQ ID NO :12所示的下游引物，由SEQ ID NO : 13所示的探针，其中SEQ ID N0:13所示的核苷酸序列的5’端有Fam标记,3’端有Tamara标记。
2.一种含有权利要求I所述检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的组成为所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、对照品和参考品，其中，所
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于， 检测BCR-ABL融合基因的RT-PCR反应液I中含有5 XBuffer液5 μ 1，IOmmoI/L的dNTPs 各 O. 25 μ l,50ymol/L 的 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 5 各 O. 12 μ l,50ymol/L SEQID NO 50. I μ 1，用工艺用水补足至8μ I ； 检测PML-RARa融合基因的RT-PCR反应液2中含有5XBuffer液5 μ 1，IOmmoI/L的dNTPs 各 O. 25 μ l，50ymol/L 的 SEQ ID NO :6 SEQ ID NO : 10 各 O. 12 μ l,50ymol/L SEQID NO 100. I μ 1，用工艺用水补足至8μ I ； 用于检测AMLl-ETO融合基因的引物和探针为中含有5XBuffer液5μ l，10mmol/L的dNTPs 各 O. 25 μ l，50ymol/L 的 SEQ ID NO :11 SEQ ID NO :12 各 O. 12μ l,50ymol/L SEQID NO 130. I μ 1，用工艺用水补足至8μ I ； RT 内参 PCR 反应液中含有5XBuffer 液 5 μ 1，IOmmoI/L 的 dNTPs 各 O. 25 μ 1，50ymol/L 的 SEQ ID NO :14 SEQ ID NO : 16各0· 12 μ 1，50 μ mol/L SEQ ID NO 160. I μ I,用工艺用水补足至8 μ I ; 参考品 PCR反应液中含有5XBuffer 液5 μ 1，10mmol/L 的 dNTPs各O. 25 μ l,50ymol/L 的 SEQ ID NO :17 SEQ ID NO :18 各 0· 12 μ 1，50 μ mol/L SEQ ID NO :160. I μ 1，用工艺用水补足至8 μ I。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的对照品为
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的参考品为
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对检测样本的要求为，所提RNA 的 0D26Q/0D28Q 在 I. 8 2. O。
7.如权利要求2所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤 (I)样本处理提取RNA核酸；阴性对照、阳性对照I与标本同时处理 取保存在Trizol里的标本400 μ 1，加入400ul氯仿，混匀，室温放置5分钟；15000rpm离心10分钟，离心后吸取无色上清液，加入等体积的buffer RLT，混匀， 具体步骤如下 ①取保存在Trizol里的标本400μ 1，加入400 μ I氯仿，混匀，室温放置5分钟；15000rpm离心10分钟,离心后吸取无色上清液； ②在上述上清中加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟；15000rpm离心10分钟，吸弃上清； ③在上述离心管中，加入300μ I预冷的70%乙醇，15000rpm离心5分钟，吸弃上清；室温10分钟，使乙醇挥发；④加入200ul DEPC-ddH20混匀溶解，以此作为相关PCR反应的模板。
(2)扩增试剂准备 从试剂盒中取出管I 7，室温融化并振荡混匀后，短暂离心I 8秒； 样本PCR预混液体系的配制 取RT-PCR反应液I 8 μ 1，加入混合酶液I 2 μ I ;单个样本配制4管； 取RT-PCR反应液2 8 μ 1，加入混合酶液I 2 μ I ;单个样本配制4管； 取RT-PCR反应液3 8 μ 1，加入混合酶液I 2 μ I ;单个样本配制4管； 取RT-内参PCR反应液8 μ 1，加入混合酶液I 2 μ I ;单个样本配制4管； 参考品PCR预混液体系的配制 取参考品PCR反应液8 μ 1，加入混合酶液II 2 μ I ;制备4管； (3)加样 从待测样本管取15 μ 1，分别加入到装有样本PCR预混液体系的PCR管中； 从抽提好的阳性对照I管取15 μ 1，分别加入到装有样本PCR预混液体系的PCR管中； 从阳性对照2管取15 μ 1，分别加入到装有样本PCR预混液体系的PCR管中； 从抽提好的阴性对照管取15 μ 1，分别加入到装有样本PCR预混液体系的PCR管中； 从参考品I 4管分别取15 μ I加至装有参考品PCR预混液体系的PCR管中，盖紧管盖、将其移至检测区；(4)PCR 扩增ABI PRISM 荧光 PCR 检测系统扩增条件42°C，30min ；94°C，5min ； (94°C，15sec ；60°C，60seC)40个循环；反应体系为25ul ;在？0 循环第二步60°C时收集荧光信号；检测通道为FAM-TAMRA，参比荧光设定为none ；StratagenePCR 突光检测仪扩增条件42 °C，30min ；94 °C，5min ； (94 °C，45sec ；60 °C，80seC)40个循环；反应体系为25ul ;在？0 循环第二步60°C时收集荧光信号；检测通道为FAM-TAMRA ； (5)检测 (1)确定基线选择3 15个循环的平均突光信号为基线； (2)确定阈值在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，且阴性对照未检出，确定为起始阈值； (3)计算机自动处理和分析数据。
8.如权利要求2所述的试剂盒的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤 (I)有效性判定 四个参考品的Ct值小于36. 0，标准曲线拟合度的绝对值大于等于O. 9，判定为有效；否则视为定量无效；
9.如权利要求2所述的试剂盒的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤对于治疗后的病人，内参基因RNA检测浓度采用I X IO6Copies0
全文摘要
本发明涉及基因型的检测，具体讲，涉及一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒。该试剂盒能定性检测人骨髓标本中的白血病相关融合基因中BCR-ABL、AML1-ETO和PML-RARa的RNA量，从而指导白血病临床诊断和用药。
文档编号C12N15/11GK102827937SQ20121032754
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月6日 优先权日2012年9月6日
发明者熊慧, 程新建, 谢立群, 陈嘉铮, 包文静, 童光铨, 陈伟 申请人:上海源奇生物医药科技有限公司