番茄LoxD基因在调控植物抗性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了番茄LoxD基因在调控植物抗性中的应用。本发明提供了一种DNA片段，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第106-570位核苷酸。本发明还提供了LoxD蛋白及其编码基因在调节植物抗虫性和/或抗病性中的应用，其中LoxD蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1；所述LoxD蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明通过抑制野生型番茄中LoxD基因的表达得到转基因番茄，其抗病性和抗虫性均低于野生型番茄，从而证明，抑制植物LoxD基因的表达降低植物抗虫性和抗病性，说明LoxD该基因与植物抗病性相关。
【专利说明】番茄LoxD基因在调控植物抗性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种番茄LoxD基因在调控植物抗性中的应用。
【背景技术】
[0002]LOX(lipoxygenase,脂肪氧化酶)普遍存在于植物、动物以及真菌中，近年来发现细菌中也存在该类酶。根据LOX催化氧化二烯键的位置不同，可以分为:9_lipoxygenase和13-lipoxygenase ;根据LOX蛋白是否定位于叶绿体中，可以把LOX分为Typel和Type2两大类。在植物中，LOX不仅参与了其的生长发育过程，在植物抵抗昆虫咀食及机械损伤等抗性反应方面也起重要作用。番茄、拟南芥以及其他物种的植物基因组中均有多个拷贝的Lox基因，且不同的Lox基因具有不同的生物学功能。在JA的生物合成过程中，LOX烟草RNAi诱导的Lox沉默抑制了 JA合成，从而导致转基因植株丧失了对昆虫的抗性。拟南芥L0X-2的功能丧失破坏了受伤诱导的JA合成，但没有影响花发育。另有文献报道表明，拟南芥中的Lox3、Lox4也参与了 JA合成,而且1οχ31οχ4双突的雄性花育性受到影响,导致雄性不育。玉米的性别决定因子TASSELSEED1是定位于质体中的JA合成酶13-Lipoxygenase,TASSELSEED1的功能丧失造成玉米雄性花序不能正常发育。这些结果说明，LOX调控的JA合成在植物抗性反应和育性方面具有重要作用。目前，在番茄中已分离得到6个Lox的同源基因，其中，LOXD参与JA合成，把从质膜上释放的ALA催化形成13-HP0T (13-Hydroperoxy-octadecatrienoic acid), 13-HP0T 在经过 AOS, AOC, OPDA 及 ACXl 等一系列的酶促反应，生成JA，进而诱导一系列的信号转到途径。早在1997年，LoxD基因被克隆出来，但对LoxD的基因功能仍有待更为详尽的研究。
`[0003]已有研究表明，在过量表达系统素前体基因(Prosystemin)的转基因番茄(35S: Prosystemin, 35S: PS)中，茉莉酸诱导的抗性蛋白组成型地高表达，因而对昆虫的抗性大大提高。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一种RNA分子。
[0005]本发明提供的RNA分子，为序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸所示的DNA分子转录的RNA。
[0006]LoxD蛋白及其编码基因在调节植物抗虫性和/或抗病性中的应用是本发明保护的范围；在上述应用中，所述LoxD蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列I ;所述LoxD蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。
[0007]上述应用中，所述调控植物抗虫性和/或抗病性为如下I)或2):1)降低植物抗虫性和/或抗病性；2)提高植物抗虫性和/或抗病性。
[0008]上述应用中，所述病为番茄灰霉病，所述虫为棉铃虫。
[0009]上述应用中，所述番爺灰霉病的病原菌为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。[0010]上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为番茄。
[0011]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0012]本发明提供的方法，为失活或抑制目的植物中LoxD蛋白编码基因表达，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下I)和2)中至少一种的特性:
[0013]I)所述转基因植物的抗虫性低于所述目的植物；
[0014]2)所述转基因植物的抗病性低于所述目的植物。
[0015]所述病为番茄灰霉病，所述番茄灰霉病的病原菌具体为灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea);所述虫为棉铃虫。
[0016]上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为番爺。
[0017]上述方法中，所述LoxD蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列I ;所述LoxD蛋白编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2。
[0018]上述应用或上述方法中，上述抗虫性通过经虫取食植物后，植物中抗虫蛋白表达量和/或取食后虫体重量体现；上述抗虫蛋白具体为P1-1I ；
[0019]上述抗病性通过接种病原菌后，植物叶片菌斑直径和/或植物叶片中与抗病相关基因(P1-11、PRlbl 和 / 或 Solyc07g006380)表达体现。
[0020]上述失活或抑制目的植物中LoxD蛋白编码基因表达通过将用于失活或抑制目的植物中LoxD蛋白编码基因表达的重组载体导入目的植物中实现；该重组载体为将DNA片段插入pCAMBIA 1301的多克隆位点间得到的载体；其中，该DNA片段由正向片段、内含子和反向片段组成；所述反向片段核苷酸序列为正向片段的反向互补序列；所述正向片段的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸；在本发明的实施例中，重组载体为pCAMBIA 1301-LoxDRNAi，为将上述DAN片段插入pCAMBIA1301的PstI酶切位点间得到的载体。
[0021]本发明的实验证明，本发明通过抑制野生型番茄中LoxD基因的表达得到转基因番茄，其抗病性和抗虫性均低于野生型番茄，从而证明，抑制植物LoxD基因的表达降低植物抗虫性和抗病性，说明LoxD基因与植物抗病性相关。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为抑制LoxD基因表达在降低番茄抵抗昆虫
[0023]图2为抑制LoxD基因表达在降低番茄抵抗Botrytis病毒
【具体实施方式】
[0024]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]下述实施例中定量实验，均重复三次，结果取平均值。
[0027]下述实施例中LoxD蛋白氨基酸序列为序列表中的序列I，其编码基因LoxD的核苷酸序列为序列表中的序列2。
[0028]下述实施例中番茄采用番茄常规品种CM(Castlemart，以下也称为野生型番茄)，购自美国番爺遗传资源中心(TGRC, http://tgrc.ucdavis.edu/)。[0029]实施例1、抑制LoxD基因表达的重组载体获得
[0030]提取番爺(Solanum Iycopersicon)品种CM的总RNA,反转录得到的cDNA为模板，用引物I和引物2进行PCR扩增。
[0031]引物1:5' ~GCGCTCGAGAACCAGCAGTTTCAAGGAAGGAGG~3/ (上游引物，下划线部分碱基为XhoI识别位点)
[0032]引物2:5' -GCGACTAGTAACCGGACCACATGCAAACCCCT-3'(下游引物，下划线部分碱基为SpeI识别位点)
[0033]得到465bpPCR产物，经过测序，该PCR产物的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第106-570位核苷酸，为LoxD基因部分片段。
[0034]将上述PCR产物用XhoI和SpeI双酶切后，与经过同样双酶切的I3UCCRNAi载体(记载 Gan D, Zhang J, Jiang H, Jiang T, Zhu S，Cheng B.Bacterially expressed dsRNAprotects maize against SCMV infection.Plant Cell Rep.2010.29(11):1261-8.,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)连接，转化大肠杆菌DH5 α，挑选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒进行测序，该质粒为在PUCC RNAi载体的XhoI和SpeI酶切位点间插入序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸,表明构建的重组载体正确,记作PUCC-LoxD RNAi Forward。
[0035]将上述PCR产物经过XhoI和SpeI双酶切，与经过同尾酶SalI和XbaI双酶切的PUCC-LoxD RNAi Forward重组载体连接，转化大肠杆菌DH5 α，挑选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒进行测序，该质粒为在F1UCC-LoxD RNAi Forward载体的SalI和XbaI中插入序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸，表明构建的重组载体正确，记作PUCC-LoxDRNAi。
[0036]将构建好的PUCC-LoxD RNAi载体用PstI酶切后，回收1175bp的片段，经该片段与经过同样酶切的 PCAMBIA130`1 载体(记载 Cheng H, Song S，Xiao L, Soo HM, ChengZ, Xie D, Peng J.Gibberellin Acts through Jasmonate to Control the Expression ofMYB21, MYB24, and MYB57 to Promote Stamen Filament Growth in Arabidopsis.PLoSGenet.2009.5 (3): el000440.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)连接，转化DH5a，挑取单克隆进行扩大培养，提取质粒，利用PstI酶切验证阳性质粒(1175bp的为阳性)，命名为pCAMBIA 1301-LoxD RNAi，为抑制LoxD基因表达的重组载体。
[0037]实施例2、LoxD RNAi的转基因番茄的获得及功能鉴定
[0038]一、LoxD RNAi的转基因番茄
[0039]1、抑制LoxD基因表达的重组菌获得
[0040]将由实施例1得到的抑制LoxD基因表达的重组载体pCAMBIA 1301-LoxD RNAi转化农杆菌 AGLO (记载 Li C，Liu G, Xu C，Lee GI, Bauer P, Ling HQ, Ganal MW, HoweGA.The tomato suppressor of prosystemin—mediated responses2 gene encodes afatty acid desaturase required for the biosynthesis of jasmonic acid andthe production of a systemic wound signal for defense gene expression.PlantCell.2003.15 (7): 1646-1661.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，挑取单克隆，于含有卡那酶素与利福平抗生素的LB液体培养基中28°C过夜振荡培养，得到转化子。[0041]将转化子进行菌液PCR鉴定，采用引物I和引物2，得到465bp的为阳性重组菌，将阳性重组菌命名为AGLO/pCAMBIAl301-LoxD RNAi，并保存于_70°C备用。
[0042]2、LoxD RNAi的转基因番茄
[0043]I)、番茄转化相关培养基的配制
[0044]液体MS培养基:将4.4g MS盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，用lmol/LKOH调pH至5.8~6.0之间，高压灭菌。
[0045]种子生长培养基(1/2MS培养基):将2.2g MS盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，用lmol/L KOH调pH至5.8~6.0之间，加入0.8%的琼脂，高压灭菌。
[0046]预(共)培养培养基(Dl):将4.4g MS、1.0mg玉米素(Zeat in)和30g鹿糖溶于水中，用水定容至1L，用lmol/L KOH调pH至5.8~6.0之间，加0.8%的琼脂，高压灭菌。
[0047]筛选分化培养基(2Z):将4.4g MS盐、2.0mg玉米素、50mg卡那霉素、IOOmg肌醇、
0.5mg叶酸和20g鹿糖溶于水中，用水定容至1L,用lmol/L KOH调pH至5.8~6.0之间，加0.8%的琼脂，高压灭菌。
[0048]生根培养基:将4.4g MS盐、50mg卡那霉素、0.5mg叶酸、0.5mg吲哚丁酸和30g鹿糖溶于水中，用水定容至1L，用lmol/L KOH调pH至5.8~6.0之间，加0.8%的琼脂，高压灭菌。
[0049]2)、LoxD RNAi的转基因番茄的制备
[0050](I)转化外植体的`准备
[0051]取野生型番茄(品种CM)，挑选饱满、粒大种子，用40% NaCl浸泡20min，用无菌水冲洗5遍，播种于种子生长培养基上，于25°C、16h光照/8h黑暗条件下光照培养。萌发8天后，在无菌条件下用锋利的剪刀将子叶切成小方块(动作应快)，将子叶小方块接种于预培养培养基中，于25°C、16h光照/8h黑暗条件下培养，2d后，可用于番茄转化。
[0052](2)侵染液的准备
[0053]将保存备用的AGLO/pCAMB IA 1301-LoxD RNAi接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28°C、200rpm过夜培养。次日以1:100的比例转接至新的LB液体培养基中，28°C、200rpm培养至0D600=0.7。菌液以5000rpm离心IOmin,弃上清液,收集菌体。用液体MSO培养基重新悬浮菌体，稀释至0D600=0.4后加入50uL 0.074mol/L的乙酰丁香酮，备用。
[0054](3)外植体的转化、筛选与生根
[0055]将步骤(1)得到的子叶块分别浸入(2)制备好的侵染液lOmin，然后接种于Dl培养基上(培养基上放滤纸)共培养2天，转入到筛选分化培养基(2Z)中筛选培养，每2周继代一次，培养8周后产生抗性芽。当不定芽伸长至3cm时，用解剖刀将抗性芽切下，并转接至生根培养基上，进行生根培养，将生根的Ttl代转基因植株移入土中常规管理，收获T1代LoxD RNAi的转基因番茄种子。
[0056]上述共培养、筛选培养、生根培养的条件均为:温度为25°C、16h光照/8h黑暗。
[0057]3)、LoxD RNAi的转基因番茄的鉴定
[0058]将生长18天的两叶一心期的番茄叶片用止血钳作机械损伤，在每个小叶垂直主叶脉的方向平行夹两下，I小时后剪取植株地上部分，迅速用液氮速冻，-SO0C保存。提取T1 RLoxD RNAi的转基因番茄叶片的RNA，反转录得到CDNA，以上游引物 F:ACTCATCAGCACCGACATCG，下游引物 R:ACTCTCCAGAAAGAACTCCTGC 为引物，以野生型番茄为对照，进行RT-PCR。以actin为内参，用于扩增内参基因的上游引物为F: TTGCTGACCGTATGAGCAAG，下游引物为 R: GGACAATGGATGGACCAGAC。
[0059]结果T1代LoxD RNAi的转基因番茄中LoxD基因的相对表达量为0.0205 ；
[0060]野生型番茄中LoxD基因的相对表达量为0.0142 ；
[0061]可以看出，与野生型番茄比，T1 RLoxDRNAi的转基因番茄中的LoxD基因的表达受到抑制，为阳性转基因植物。
[0062]4)纯合转基因植物的获得
[0063]将上述鉴定为阳性的T1代LoxDRNAi的转基因番茄植株收种得到T2代种子，消毒后播在800 μ L/L潮霉素的1/2MS培养基上筛选(野生型CM在含潮霉素的培养基上生长，其主根和地上部分都会受到严重抑制；转基因材料由于具有潮霉素抗性生长基本不受抑制)，对潮霉素有抗性的为T2代LoxDRNAi的转基因番茄，得到纯合体。
[0064]采用同样的方法将空载体pCAMBIA 1301转入野生型番茄中，得到Ttl代转空载体番茄，收种、播种，直到得到T2代转空载体番茄。采用同样的方法检测其LoxD基因相对表达量，结果表明，T2代转空载体番茄叶片中LoxD表达量与野生型番茄相比，无显著差异。
[0065]二、LoxD RNAi的转基因番爺对昆虫抗性影响
[0066]1、昆虫饲喂试验
[0067]棉铃虫(Helicoverpaarmigera)记载在文献“Wu K., Y.Lu, H.Feng, Y.Jiang, andJ.Zha0.2008.Suppression of cotton bollworm in multiple crops in China in areaswith Bttoxin-containing cotton.Science.321 (5896): 1676-1678.，，中公开过，公众可从
中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0068]在昆虫饲喂前，将转基因番爺35S:PS (记载在“Howe GA, Lightner J, BrowseJ, Ryan CA.1996.An octadecanoid pathway mutant(JL5)of tomato is compromised insignaling for defense against insect attack.Plant Cell.1996.8(11): 2067-77.中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)、野生型番茄、T2代转空载体番茄和T2RLoxDRNAi的转基因番茄在常规条件下培养:光照16h，黑暗8h，光照强度70microeinsteins温度25°C。待植物长至4周时,取长势一致的2龄期棉铃虫小心
放到植物上,任其自由取食。上述每个株系取20株进行试验，每棵植株放3头棉铃虫。
[0069]2、蛋白酶抑制剂II检测
[0070]植物体内的蛋白酶抑制剂是一种抵抗昆虫侵害的抗性蛋白。这种富含丝氨酸的小分子量碱性蛋白质分子，通过抑制昆虫肠道内消化酶的活性而达到抗虫的目的。20世纪70年代Ryan教授发现，昆虫侵害和机械损伤能够诱导蛋白酶抑制剂的合成，蛋白酶抑制剂的表达量作为衡量植物对昆虫抗性的强弱的重要指标，是JA信号传导途径的下游基因，受JA上调，而LoxD是催化JA合成途径中的第一个关键酶，因此，LoxD基因表达量的降低，导致JA含量的降低，最 终导致蛋白酶抑制剂II表达量的降低。
[0071]待到饲喂第7天时，对植物和棉铃虫进行拍照记录，并利用免疫扩散测定蛋白酶抑制剂II含量，具体如下:
[0072]A.蛋白酶抑制剂II盘的制备
[0073]1)首先配制10 X buffer (放射免疫扩散盘缓冲液)贮存液(500ml):
[0074]药品重量终浓度[0075]Tris Base 12.1g 200mM Tris[0076]NaCl 45g 9% NaCl
[0077]调pH至8.5，用蒸馏水定容至500毫升，高压灭菌，当溶液冷却后备用。
[0078]2)向 250ml 三角瓶内加入 100ml IXbuffer (10ml 10Xbuffer+90ml 蒸馏水)，同时加入磁棒在加热磁力搅拌器上搅动。
[0079]3)加入2g琼脂(Noble Agar)，加热直沸腾，使琼脂颗粒充分溶解。
[0080]4)缓慢搅动让溶液逐渐冷却至58°C,加入Iml的蛋白酶抑制剂II羊抗血清(用蛋白酶抑制剂II抗原免疫羊制得，该蛋白酶抑制剂II编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3)，此溶液即为I %抗血清的免疫扩散盘琼脂固定液。
[0081]5)将Ilml该固定液加入一刻度方型的培养皿(Falcon351012Integrid)，使其完全盖住培养皿的底部，形成均匀的一层。冷却后用封口膜将其封闭，保存在4°C条件下备用。
[0082]B、蛋白酶抑制剂II含量放射免疫扩散测定
[0083]I)分别收获处理后的番茄受伤叶片(棉铃虫取食后的叶片)，研磨挤压叶片。
[0084]2)吸取5μ I番茄叶片汁液加在已制备好的蛋白酶抑制剂II盘相应的小方格中央的小孔中，放置24小时。
[0085]3)向蛋白酶抑制剂II盘中倒入7%的乙酸溶液，让溶液覆盖盘面，反应5分钟后，倒掉乙酸溶液，用蒸馏水冲洗。
[0086]4)结果观测，精确测定蛋白酶抑制剂II盘内的免疫扩散环的直径(厘米)，精确到毫米。应用于下列公式计算出蛋白酶抑制剂II的含量。蛋白酶抑制剂II含量公式:蛋白酶抑制剂II含量(yg/ml汁液)=(环直径数据X环直径数据X 10000-625) X0.016。
[0087]结果如图1所示，
[0088]IA为观察35S:PS、野生型番茄和T2RLoxD RNAi的转基因番茄的表型，可以看出，T2RLoxD RNAi的转基因番茄在昆虫饲喂实验中更容易受到伤害其植株叶片被棉铃虫几乎咀食干净。而昆虫咀食后的35S:PS和野生型番茄仍然生长正常。
[0089]川为355:?5、野生型番茄和1'2代1^?0 RNAi的转基因番茄中蛋白酶抑制剂II含量结果，由图可以看出，昆虫咀食前，35S: PS的蛋白酶抑制剂含量为58.6mg/mL,野生型和T2代LoxDRNAi的转基因番茄中蛋白酶抑制剂II含量均为O ;昆虫咀食后，35S:PS，野生型和T2代LoxDRNAi的转基因番茄叶片中蛋白酶抑制剂II含量分别为436.7mg/mL, 454.2mg/mL与18.6mg/mL ;表明，昆虫咀食后，35S:PS和野生型植物叶片中的蛋白酶抑制剂II蛋白受到强烈诱导积累，而T2 RLoxD RNAi的转基因番茄叶片中的蛋白酶抑制剂II蛋白并未受到明显诱导。
[0090]IC为35S:PS、野生型番茄和T2代LoxD RNAi的转基因番茄上的昆虫生长情况，可以看出，在饲喂7天时观察，T2代LoxD RNAi的转基因番茄上的昆虫生长健康，体重较大，这是由于T2 RLoxDRNAi的转基因番茄中蛋白酶抑制剂II蛋白积累量非常少，所以昆虫生长健康，体重随着饲喂时间而增加的速度也较35S:PS和野生型植株上的昆虫快。
[0091]ID为35S:PS、野生型番茄和T2代LoxD RNAi的转基因番茄上的昆虫体重；在饲喂7天时，35S:PS、野生型番茄和T2代LoxDRNAi的转基因番茄上的每只昆虫的平均体重分别26.7mg、62.8mg 和 241.8mg。
[0092]野生型番茄和T2代转空载体番茄的结果无显著差异。[0093]从上述结果表明，LoxDRNAi的转基因番茄在受到昆虫嚼食后抗虫蛋白蛋白酶抑制剂II积累少量甚至为0，同时在LoxD RNAi的转基因番茄上的昆虫体重增加，说明与35S:PS和野生型相比，LoxD RNAi的转基因番茄对昆虫的抗性显著降低，表明LoxD基因具有抗虫作用，抑制其表达会使抗虫性降低。
[0094]三、LoxD RNAi的转基因番茄对番茄灰霉病的病原菌侵染的影响
[0095]1、Botrytis的培养与孢子收集
[0096]番爺灰霉病的病原菌为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)记载在AbuqamarS,ChaiMF, Luo H, Song F，Mengiste T.Tomato protein kinase Ib mediates signalingof plant responses to necrotrophic fungi and insect herbivory.PlantCell.2008.20(7): 1964-83.公众可从中科院遗传与发育生物学研究所获得。
[0097]挑取少量番爺灰霉病致病菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)菌丝,接种在potatodextrose agar (PDA)培养基上，于24° C光周期为12h/12h条件下培养20天时，收集孢子。用镊子在培养基上刮取菌丝，放入灭菌水中，充分振荡，使孢子脱离菌丝；利用8层纱布过滤悬浮液以去除菌丝，将滤液1000rpm离心8min ;小心倒掉上清液,用potato dextrosebroth(PDB)重悬孢子，利用血球计数板进行孢子浓度计算并调至试验浓度5X IO5个，得到灰葡萄孢菌孢子液。
[0098]2、离体叶片接菌实验[0099]将35S:PS、野生型番茄、T2代转空载体番茄和T2 RLoxDRNAi的转基因番茄在常规条件下培养:光照16小时,黑暗8小时,光照强度70microeinsteins HT2SA温度25°C。待植物长至4周时，选取生长一致的植物，剪取第三叶位的番茄小叶，放于0.8%琼脂板上，并将叶柄基部插于琼脂中，在每片叶子中部滴加5μ L上述I得到的灰葡萄孢菌孢子液，放于光照培养箱中培养72h，培养条件为:光照16小时，黑暗8小时，光照强度70microeinsteinsm_2s_2，温度25°C。然后测量统计菌斑直径。每个株系10株，实验重复三次，结果取平均值。
[0100]表型观察结果如图2A所示，离体叶片接种灰葡萄孢菌孢子液3天，35S:PS和野生型的菌斑直径较T2代LoxDRNAi的转基因番茄的菌斑小，但二者之间没有显著差异，表现为感病性差。
[0101]离体叶片接种灰葡萄孢菌孢子液3天统计菌斑直径结果如图2B所示，35S:PS、野生型番茄和T2代LoxD RNAi的转基因番茄的菌斑直径分别为0.5cm、0.5cm和1.2cm ;可见T2代LoxDRNAi的转基因番茄用菌侵染3天后，其菌斑直径显著高于35S:PS与野生型，几乎是二者的2.4倍，表现为强感病性。
[0102]野生型番茄和T2代转空载体番茄结果无显著差异。
[0103]3、活体叶片接菌实验
[0104]I)活体叶片接菌
[0105]将35S:PS、野生型番茄、T2代转空载体番茄和T2RLoxD RNAi的转基因番茄在常规条件下培养:光照16小时,黑暗8小时,光照强度70microeinsteins m_2s_2,温度25。。。待植物长至20天时，选取生长一致的植物，在每片小叶上滴加5 μ L述I得到的灰葡萄孢菌孢子液，每片大叶滴加三片小叶，以保证每株植物滴加相同量的孢子。将滴有孢子液的植物放于密闭的有机玻璃箱中，确保灰葡萄孢菌侵染的高湿条件。每个株系5株，实验重复三次，结果取平均值。[0106]分别于接种I天、2天和3天时取番茄叶片，并用液氮速冻，于-80°C保存，用于RNA提取，及后续的抗性基因表达分析。
[0107]2)抗病性基因表达检测
[0108]A、番茄叶片RNA提取
[0109]总RNA的提取用Trizol法提取:
[0110]I)将各株系上述I)不同时间取的番茄叶片在液氮中磨成粉末后，取IOOmg叶片粉末转入加有ImL Trizol提取液的RNase-free离心管中，震荡混匀。
[0111]2)研磨液室温(25°C)放置5分钟，加入0.2mL氯仿，盖紧离心管，剧烈摇荡离心管20秒，室温放置3分钟。40C 12000g离心15分钟。
[0112]3)取上层水相约600 μ L于一新离心管，加0.5mL异丙醇，室温放置10分钟，4°C，12000g离心10分钟。
[0113]4)弃去上清液，加入ImL的75%乙醇，涡旋混匀，4°C下12000g离心I分钟。
[0114]5)重复步骤4)，小心弃去上清液，然后室温或真空干燥10分钟，溶解于DEPC处理过的双蒸水中，得到RNA。
[0115]B、单链cDNA的合成
[0116]I)在200 μ L的RNase-free离心管中加入下列试剂:
[0117]模板RNA (总 RNA)2 μ g
[0118]引物Oligo (dT)` 18 (0.5 μ g/μ L) I μ L
[0119]RNase-free ddH20补至 13 μ L
[0120]2)轻轻混匀后离心3~5s，70°C反应5分钟，迅速置于冰上冷却5分钟，然后加入:
[0121]
5XReaction Buffer5 μ Ij
dNTP Mix5 μ L
RNase InhibitorIpL
MMLV- RTIpL
[0122]3)终体积为25L。轻轻混匀后稍离心，42°C反应60分钟，94°C反应5分钟后，置冰上进行后续实验或-20°C冷冻保存，得到cDNA。
[0123]C、荧光定量RT-PCR分析
[0124]I)反应体系
[0125]SYBR Premix Ex Taq (2X ) 10 μ L
[0126]
上游引物0.5uL
下游引物0.5uL
cDNA0.5 μ L
ddH208.5 μ L
[0127]2)反应程序
[0128]95°C,30s ；45cycles of (95°C, IOs ；60°C,20s ；72°C,20s)
[0129]3)数据分析[0130]Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
[0131]ACt=Ct(Gene)-Ct(Actin),以2_ΔΜ的值衡量基因的转录水平。
[0132]涉及到的定量PCR分析表达的基因及所用引物如下所示:
[0133]内参基因为Actin，用于扩增内参基因的上游引物为F:TTGCTGACCGTATGAGCAAG，下游引物为 R:GGACAATGGATGGACCAGAC ；
[0134]蛋白酶抑制剂II (P1-1I，该基因的核苷酸序列作为序列3)，用于扩增蛋白酶抑制剂II的上游引物为F:AATTATCCATCATGGCTGTTCAC，下游引物为R:CCTTTTTGGATCAGATTCTCCTT ；
[0135]PRlbl (该基因的核苷酸序列为序列4)，用于扩增PRlbl的上游引物为F:TGGTATTAGCCATATTTCACTC，下游引物为 R: CACATTGGTTGGTAGCGTAG ；
[0136]Solyc07g006380(该基因的核苷酸序列为序列5)，用于扩增Solyc07g006380的上游引物为 F: GTCTTGGCAATGATGCTCTTTGTTAC，下游引物为 R: TGAGATTTTGTCAAATACACATGG。
[0137]上述抗病性基因表达的检测结果如图2C-E所示，具体如下:
[0138]图2C为P1-1I基因的表达结果，从图中看出，接种病原菌后，与35S:PS、野生型番茄相比，T2RLoxD RNAi的转基因番茄中P1-1I基因的相对表达量显著降低；且P1-1I在接种I天后表达量最高，随着时间的延长逐渐下降。
[0139]图2D为PRlbl基因的表达结果，从图中看出，接种病原菌后，与35S:PS、野生型番茄相比，T2代LoxD RNAi的转基因番茄中PRlbl基因的相对表达量显著降低。
[0140]图2E为Solyc07g006380基因(番茄中PDF1.2的同源基因)的表达结果，从图中看出，接种病原菌后，与35S:PS、野生型番茄相比，T2RLoxD RNAi的转基因番茄中Solyc07g006380基因的相对表达量显著降低；且Solyc07g006380基因在接种I天时表达量最高，随着时间的延长逐渐下降。
[0141]野生型番茄和T2代转空载体番茄结果无显著差异。
[0142]从上述结果可以看出，接种番爺灰霉病的病原菌灰葡萄孢菌Botrytis cinerea后，LoxDRNAi的转基因番茄的叶片菌斑大小和抗病性基因P1-11、PRlbU Solyc07g006380表达量均低于35S:PS、野生型番茄，说明LoxD基因具有抗番茄灰霉病虫作用，抑制其表达会使抗番爺灰霉病降低。
【权利要求】
1.一种RNA分子,为序列表中的序列2自5’末端第106-570位核苷酸所不的DNA分子转录的RNA。
2.LoxD蛋白及其编码基因在调控植物抗虫性和/或抗病性中的应用；所述LoxD蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列I ;所述LoxD蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述调控植物抗虫性和/或抗病性为如下I)或2):1)降低植物抗虫性和/或抗病性；2)提高植物抗虫性和/或抗病性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述病为番茄灰霉病；所述虫为棉铃虫。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于: 所述番爺灰霉病的病原菌为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。
6.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为番茄。
7.一种培育转基因植物的方法，为失活或抑制目的植物中LoxD蛋白编码基因表达，得到转基因植物；所述转基 因植物具有如下I)和2)中至少一种的特性: 1)所述转基因植物的抗虫性低于所述目的植物； 2)所述转基因植物的抗病性低于所述目的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于: 所述病为番茄灰霉病，所述番茄灰霉病的病原菌具体为灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea);所述虫为棉铃虫。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于:所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为番茄。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于:所述LoxD蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列I ;所述LoxD蛋白编码基因的核昔酸序列具体为序列表中的序列2。
【文档编号】C12N15/11GK103667265SQ201210328324
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月6日 优先权日:2012年9月6日
【发明者】李传友, 闫留华, 王保, 翟庆哲 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所