专利名称：一种极端嗜热菌utm801及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种极端嗜热菌UTM801及其应用。
背景技术：
好氧堆肥已成为有机 固废资源化的重要手段之一。エ业化上好氧堆肥高温阶段的最高温度一般为50 60°C，极端温度可超过80°C，故又称高温堆肥。高温对于好氧堆肥进程产生重要影响，是一把双刃剑。一方面，由于只有在高温阶段，堆体内才能开始形成腐殖质和病原菌被灭活的过程，物料的快速腐熟和卫生学无害化离不开高温；另一方面，由于微生物有机体的重要组成物质如蛋白质、核酸等对温度敏感，将随着温度的升高遭受不可逆的破坏而导致机体的死亡，使微生物种群活性受到很大的抑制，表现为种类单一，数量减少，比中温阶段要少I 2个数量级，这无疑限制了有机物质的快速降解。因此，在日常堆肥化过程中，既要设法保持堆体的高温，又要预防温度升得太高，这无疑増加了堆肥管理的复杂性和成本。极端嗜热菌是最适生长温度在65°C以上，最低生长温度在40°C以上，最高生长温度超过70°C的ー类高温微生物。在有机固废好氧堆肥过程中，接种高温微生物较接种常温菌相比，有着许多优势高温菌较常温菌具有更高的活性和更快的代谢速率，可以加快有机物质的降解速率，缩短发酵时间；能更有效的杀灭病原微生物；高温菌具有热稳定性的降解酶，可以将发酵温度維持在60°C 70°C或更高的温度，所以可以更加有效地杀死病原微生物，达到卫生化的要求，同时对不良化学环境也具有高度的耐受性，抵抗ー些有毒害作用的污染物或代谢产物的抑制作用，提高处理效率，缩短生产周期。高温微生物的应用可为有机固体废物的高温堆肥处理更好的实现卫生化、无害化、稳定化，并为其资源化利用的エ业化生产创造有利条件。Calditerricola是日本人2011年报道的新属，由从最高堆温达到95°C 100°C的高温堆肥中，分离得到的两种极端嗜热菌Calditerricola satsumensis和Calditerricola yamamurae 组成。其中，极端嗜热菌 Calditerricola satsumensis 己被应用于堆肥中(专利名称新的微生物，专利申请号02826097.X)，但另ー种极端嗜热菌Calditerricolayamamurae在有机固废堆肥上的应用尚未见公开报道。
发明内容
本发明目的是提供一种极端嗜热菌UTM801及其在堆肥中的应用。本发明从高温期污泥堆肥中，经高温富集、分离纯化得到极端嗜热菌Calditerricola yamamurae UTM801菌株。该菌株于2012年6月4日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号CGMCC No. 6185。所述极端嗜热菌Calditerricola yamamurae UTM801的鉴定特征是(I)为革兰氏阴性、好氧菌且不形成孢子，菌体呈长杆状；70-80°C生长活跃，在50°C下不生长。(2)利用引物(27f):5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和(1492r):5' -GGTTAC CTT GTT ACG ACT T_3 '经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，其核苷酸序列如SeqID No. I所示,将获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示与Calditerricolayamamurae YM0722 的相似性最高，为 99. 04%。(3) 70°C和80°C下，在合成培养基(I. Og可溶性淀粉，3. Og谷氨酸，O. Sg蛋氨酸， 0.14g K2HPO4,0. 028g KH2PO4,1. Og NH4Cl, 2. Og NaCl，0. 125g MgCl2,0. 025g CaCl2, IOmgFeSO4 · 7H20,100ml 微量元素营养液(12g Na2MoO4 · 2H20, Ig VOSO4 · xH20, 5gMnCl2,0. 6gZnSO4 · 7H20，0. 15g CuSO4 · 5H20，8g CoCl2 · 6H20，0. 2g NiCl2 · 6H20)，400mg 生物素，400mg叶酸，400mg硫胺，pH 7. 5)上能生长。本发明还提供含有所述极端嗜热菌UTM801的高温堆肥种子，含有极端嗜热菌UTM801 活菌数为 IO3 105cfu/g。UTM801高温堆肥种子的制备方法，包括以下步骤I)制备发酵种子液将UTM801斜面菌种接种改良YTPG固态斜面上培养；将活化的菌种接种于改良YTPG液态培养基培养；2)制备高温堆肥种子以调理剂吸附发酵种子液，与堆肥物料混匀，发酵，干燥，筛分制得。其中，步骤(I)中所述菌种活化的方法是取4°C保存的UTM801斜面菌种转接至改良YTPG固态斜面上，在65°C 80°C下培养至丰厚。所述改良YTPG固态斜面的配方是酵母提取物1.5 2. 5g/L，细菌蛋白胨
1.5 2. 5g/L，葡萄糖I. 5 2. 5g/L，PIPES 4. 5 7. 5g/L，余液为浸提液，pH 7. 2 7. 4 (用固态NaOH调节)，植物凝胶8 12g/L，琼脂15 20g/L。所述浸提液制备方法称取50g 100g —次发酵后腐熟堆肥(含水率小于30%)，カロ入250ml蒸馏水，在室温下，15(T200rpm振荡8 16小时；取振荡液在300(T4000rpm下离心5 20min，收集上清液，得浸提液母液，在4°C保存备用；使用吋，用蒸馏水稀释广3倍即为培
养基浸提液。所述发酵种子液制备的方法是取活化培养至丰厚的斜面I个，用无菌水冲洗菌落至IOOOml改良YTPG液态培养基中，在恒温摇床上振荡培养，得发酵种子液。所述改良YTPG液态培养基同上述改良YTPG固态斜面配方，不同之处在于不含植物凝胶和琼脂。所述发酵种子液的培养条件是 温度6(T80°C，转速12(T200rpm，培养2 4天。其中，步骤(2)中所述高温堆肥种子的制备方法是取腐熟污泥堆肥、鸡粪、辅料为堆肥物料，用调理剂吸附发酵种子液进行接种，混合均匀后进行堆置发酵，经干燥、筛分后得到的。所述腐熟污泥堆肥、鸡粪、辅料和调理剂的混合质量比是(广2) :(3飞)(广3)(O. 3 O. 8)。所述腐熟污泥堆肥为一次发酵后的含水率在30%以下的腐熟堆肥，其污染物限值符合污泥农用A类泥质标准(CJT 309-2009)；所述辅料为花生壳、糠醛渣、米糠中的ー种或几种；
所述调理剂玉米面、麸皮、豆柏中的ー种或几种；所述堆肥物料含水率48% 56%。具体地，将广2倍于发酵种子液的糖蜜或红糖与发酵种子液混合后用调理剂吸附，与堆肥物料混合均匀，进行堆置发酵。发酵种子液的接种量为物料干重的O. 039Γ0. 12%。所述堆置发酵的跺体高度为I. 2^1. 6米，发酵后每Γ10天翻堆一次，直至温度下降至30°C以下，再将物料进行干燥至含水率25%以下，粉碎过筛得高温堆肥种子。所述高温堆肥种子在有机固废堆肥化中的应用方法是按重量比19Γ5%与有机固废混合即可。所述有机固废初始含水率为50-60%、C/N为10-25、ρΗ5-8。本发明的有益效果是本发明提供的极端嗜热菌UTM801是在 80°C下筛选出来的，热稳定性好，代谢活性不受高温堆肥温度的抑制，适应性強；利用有机固废作为原料制备高温堆肥种子，具有处理有机固废和能源/资源再生利用的三重功效。同吋，将本发明接种剂应用于有机固废高温堆肥处理，可大大简化堆肥管理、提高处理效率、缩短堆肥周期、降低处理成本。
图I为堆肥过程温度的变化；图2为堆肥过程有机物降解率的变化；图3为试验过程发芽指数的变化。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1UTM801的分
离称取5g高温期污泥堆肥样品于装有15个玻璃珠与50ml无菌水的150ml三角瓶中，置于摇床上160rpm振荡I小时，使样品充分散开，然后放置80°C下，静置3小吋。取无菌平皿，吸取Iml高温富集液和低倍稀释液，接入已作好标记的平皿中；将已融化并冷却至55°C左右的改良YTPG培养基倒入无菌培养皿中，每皿约30ml，前后左右轻轻摇动培养皿，与富集液充分混匀，待凝固。将凝固后的平板倒置于密闭容器中，同吋，每密闭容器中放置一个装有蒸馏水的培养皿，置于培养箱中80°C培养。每天观察，待长出菌落后，仔细观察菌落特征，确定不同类型菌株，继续采用改良YTPG培养基平板上进行划线分离纯化，从平板上菌落形态特征和简单染色后显微镜下多视野确认菌体形态一致后得到纯菌，并继续在80°C下传代培养5代，淘汰生长不稳定的菌株，得到极端嗜热菌UTM801。将UTM801转接转至改良YTPG培养基斜面，培养至丰厚在4°C保藏备用。其中，改良YTPG培养基的配制方法是(I)浸提液制备先称取50g—次发酵后的腐熟污泥堆肥，加入250ml蒸懼水,在室温下，180rpm振荡过夜；取振荡液在4000rpm下离心lOmin，收集上清液，在4°C保存备用；使用吋，用蒸馏水稀释2倍即为培养基浸提液。(2)按培养基配方(酵母提取物2. Og，细菌蛋白胨2. Og，葡萄糖2. Og，PIPES 6. 0g，培养基浸提液1000ml，pH 7.2 (用固态NaOH调节)，植物凝胶10g，琼脂15g)配制，在121°C下灭菌25分钟。
实施例2UTM801的鉴定将实施例I所得到的本发明极端嗜热菌UTM801在改良YTPG培养基平板上，80°C下培养24小时，观察其特征，结果它是革兰氏阴性、好氧菌且不形成孢子，菌体呈长杆状。以本发明菌株UTM801的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA序列，引物为(27f)5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 '和(1492r):5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3'。PCR反应程序为:95で预变性511^11，95で变性308，53で退火458，72で延伸908，30个循环，72°C延伸lOmin。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ IDNo. I 所不。获得的 16S rDNA 基因序列通过 EzTaxon 数据库(http://www. eztaxon. org/)进行比对，同源性在97%以上的菌株只有Calditerricola yamamurae YM0722 (相似度99. 04%)和 Calditerricola satsumensis YM081 (相似度 97. 74%),故将 UTM 801 鉴定为Lalditerricola 属。 配制合成培养基(I. Og可溶性淀粉，3. Og谷氨酸，O. Sg蛋氨酸，O. 14g K2HPO4,O. 028g KH2PO4,1. Og NH4Cl, 2. Og NaCl，O. 125gMgCl2，O. 025g CaCl2, IOmg FeSO4 ·7Η20，IOOml 微量元素营养液(12g Na2MoO4 · 2H20，Ig VOSO4 · xH20, 5g MnCl2,0. 6gZnS04 · 7H20，0. 15gCuSO4 · 5H20，8g CoCl2 · 6H20，0. 2gNiCl2 · 6H20)，400mg 生物素，400mg 叶酸，400mg 硫胺，pH7. 5)，接种UTM801，发现在70°C和80°C下均能生长。结合文献报道，将该菌株鉴定为Calditerricola yamamurae,命名为Calditerricolayamamurae UTM 801,并于2012年6月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCjii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏,分类命名为Calditerricola yamamurae,保藏号为CGMCC No. 6185。实施例3温度与生长的关系将UTM 801菌株接种于改良YTPG培养基平板上在75°C下活化培养24小时。然后接种于改良YTPG培养基上，在培养温度40 V、50°C、60 V、70°C、80 V下培养。根据温度标记，分别放入不同的恒温箱中培养，在24小时后观察菌株长势，辨别菌株的生长情況。将观察结果填入下表2。“一”表示不生长；“ + ”表示微生长；“++”表示中度生长；“+++”表示生长良好。表I不同温度对微生物生长的影响
权利要求
1.极端嗜热菌(Calditerricolayamamurae) UTM801,其保藏号为CGMCC No. 6185。
2.含有权利要求I所述极端嗜热菌UTM801的高温堆肥种子。
3.根据权利要求2所述的高温堆肥种子，其特征在于，含有极端嗜热菌UTM801的活菌数为 IO3 105cfu/g。
4.权利要求2或3所述高温堆肥种子的制备方法，包括以下步骤 O制备发酵种子液将极端嗜热菌UTM801活化，制备发酵种子液； 2)制备高温堆肥种子以调理剂吸附发酵种子液，与堆肥物料混匀，发酵，干燥，筛分得至IJ。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述调理剂为玉米面、麸皮、豆柏中的ー种或几种；所述堆肥物料为腐熟污泥堆肥、鸡粪和辅料；其中，所述辅料为花生壳、糠醛渣、米糠中的ー种或几种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述腐熟污泥堆肥、鸡粪、辅料和调理剂的质量比为Γ2 :3 6 Γ3 0. 3 O. 8。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述腐熟污泥堆肥含水率在30%以下，所述堆肥物料含水率为48°/Γ58%。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在干，所述发酵种子液的接种量为堆肥物料干重的O. 03%"0. 12%。
9.权利要求I所述端嗜热菌UTM801菌株或权利要求2所述高温堆肥种子在有机固废堆肥化中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述高温堆肥种子按重量比19Γ5%与有机固废混合物混合。
全文摘要
本发明涉及极端嗜热菌(Calditerricola yamamurae)UTM801，其保藏号为CGMCC No.6185。利用有机固废作为原料制备高温堆肥种子，具有处理有机固废和能源/资源再生利用的三重功效。将本发明高温堆肥种子应用于有机固废高温堆肥处理，可大大简化堆肥管理、提高处理效率、缩短堆肥周期、降低处理成本。
文档编号C12R1/01GK102851247SQ20121034322
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者刘永跃, 周顺桂, 许宜北, 汪涌 申请人:大地绿源环保科技(北京)有限公司