专利名称：一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因序列获取方法
技术领域：
本发明在已知部分序列的基础上，采用5' -RACE(快速获取5'端序列)技术获取粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶的全长基因，属于基因克隆技术领域。
背景技术：
苯丙氨酸脱氨酶(PAL)在pH 8. O时催化L-苯丙氨酸(L_phe)脱氨生成反式肉桂酸和氨，pH 11. O时能催化逆向反应合成L-phe，工业上利用这一特性，生产人体必须氨基酸L-phe和甜味剂阿斯巴甜。PAL广泛存在于植物、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌， 尤其是红酵母属中。其中粘红酵母(Rhodotorula glutinis)可以在廉价的原料如玉米粉， 糖浆，糖蜜，豆柏，味精废水等工业废料上生长，容易实现大规模的培养，已经成功应用于食品、制药等工业领域。但是由于该酶是诱导酶，在对数生长期酶活达到峰值后，酶活下降较快，稳定性差。为进一步提高酶活和稳定性，需要采用分子生物手段对酶进行分子改造，但到目前为止，仅仅获得部分的cDNA。为进一步提升该酶的工业应用价值，对粘红酵母PAL 进行改造，首先需要获得全长的基因序列，本专利的方法是根据已经报道部分粘红酵母PAL 的cDNA序列的基础上(GenBank DQ013364.1)，成功获得粘红酵母PAL全长的基因序列。
发明内容
本发明的目的是提供一种获取粘红酵母PAL全长基因序列的方法。
本发明的具体步骤如下
(I)提取粘红酵母总RNA。
(2)反转录获得cDNA。
(3)获得pal 5'端的序列
(4)构建克隆载体pUCm-T-pal,测序,获得全长的序列。
本发明的详细的步骤为
I提取粘红酵母总RNA
(I)从粘红酵母平板上挑取单菌落至5mL的种子培养基中于30°C培养24h后，取 50 μ L的种子液至装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30°C培养18_20h至OD6tltl = 1.0, 1500g离心5min收集菌体，用冷水将菌体洗涤2次，弃上清。
(2)用 400 μ L 的 TES (IOmM Tris-HCl, IOmM EDTA，0. 5% SDS, ρΗ7· 5)缓冲液重悬细胞，加入400 μ L酸性酚，剧烈震荡10sec，65°C温育lh，不时用涡旋振荡器短暂震荡。
(3)冰育 5min,于 4°C, 12000g 离心 5min。
(4)将水相移至另一 1. 5mL的离心管中，加入400 μ L酸性酚，剧烈震荡lOsec，重复步骤(3)。
(5)将水相移至另一1. 5mL的离心管中，加入氯仿,剧烈震荡IOsec,于4°C, 12000g 离心5min。
(6)将水相移到新的1. 5mL离心管中，加入40ul的3M NaAc及Iml冰冷的无水乙醇，于 4°C，12000g 离心 5min。
(7)加入lmL，75%乙醇快速震荡洗涤RNA沉淀。
(8)沉淀于无菌操作台上风吹15min至酒精挥发完全，加入经DEPC处理的无菌水 50 μ L重悬，-80°c保藏备用，采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。
2反转录，获得cDNA
(I)于 0.5mL 的离心管中加入 50ng总 RNA，lyL 5，-CDS (5，-(T)25VN (N = A，C，G， T ;V = A，G，C)-3，)和 IyL SMARTer II A Oligonucleotide (5' -AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACGGGGG-3')，加水至 4. 75 μ L 混匀。
(2)72°C温育 3min 后于 42。。温育 2min, I5OOg 离心 IOsec0
(3)力口入 2yL 5Xbuffer(250Mm Tris-HCl, 375mM KCl,30mM MgCl2)，I μ L 的 DTT (20mM)，I μ L dNTP (IOmM)，0· 25 μ L RNase 抑制剂和 I μ L SMARTer 反转录酶，42。。温育90min后于70°C变性lOmin，冷却至室温加入20 μ L无菌水，获得cDNA。
3犾得pal 5'端的序列
(I)往 O. 25mL 的离心管力口入 IyL cDNA, 5 μ L Mix 引物(5 ' -CTAATACGACTCACTATAGGGCA AGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 '； 5 ' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ' )，I μ L GSP 特异性引物(5 ' -GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3 ' ) ,5μ L 10 X buffer, 5 μ L dNTP (2mM)，O. 5 μ L pfu DNA 聚合酶，3 μ L MgSO4 (25mM)，加去离子水至50 μ L。
(2)进行PCR扩增，PC R扩增条件94°C预变性4min，94°C变性lmin，58°C退火 30sec,72°C延伸60sec,25个循环,琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)往 O. 25mL 的离心管中加入 5 μ L PCR 产物，I μ L IOXTaq buffer, I μ L dATP (2mM), I μ L Taq SI (5U/ μ L)加水至10 μ L，70°C反应30min后酚仿抽提，乙醇沉淀，无菌操作台风吹15min至酒精挥发完全，用10 μ L无菌水重悬。
(4)取上一步反应液 5 μ L，加入 I μ L 连接 buffer，IyL 50% PEG, I μ L pUCm-T 载体，IyL T4连接酶，加去离子水至10 μ L，于16 °C过夜连接。
(5)取连接产物 10 μ L，10 μ L 5XKCM(O. 5Μ KC1，0.15M CaCl2,0. 25M MgCl2)，去离子水30 μ L，加至50 μ L的E. coli JM109感受态中，冰浴30min，42°C热击90sec，冰浴2min， 加入100 μ L的新鲜LB培养基，37°C培养30_60min，取100 μ L涂布含有氨苄青霉素(50ug/ mL)的LB平板，37°C培养10h，挑取单菌落，接入5mL含50ug/mL的氨苄青霉素LB培养基中 37°C培养10h，取2mL菌液提质粒进行测序，获得5'端的序列。
4构建克隆载体pUCm-T-pal
(I)根据步骤3获得的5 '端序列，设计一对特异性引物(primer F 5' -GGAATTCCATATGATGGCCCCC TCCGTCGACTCGATC-3' ；primer R 5/ -CGGAATTCCTAGTAT GGTCTACGTCCAAAGG-3 ' ),0. 25mL 的离心管加入 I μ L cDNA, primer F 和 R各 lyL，5yL 10Xbuffer,5y L dNTP(2mM),0. 5 μ L pfu DNA 聚合酶，加去离子水至 50 μ L。
(2)进行PCR扩增，PCR扩增条件94 °C预变性4min，94 °C变性lmin，58°C退火 30sec,72°C延伸2min,25个循环,琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)参照步骤3，将扩增到全长基因序列与pUCm-T连接，转入E. coli JM109，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，挑单菌落至LB培养基中37°C培养10h，取2mL菌液提质粒进行测序，获得全长的序列，采用PCR验证构建的pUCm-T-pal，分析阅读框。
图1获取粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因序列流程图
图2.提取的粘红酵母总RNA琼脂糖凝胶电泳图
图3. PCR扩增获得pal的5'端DNA的琼脂糖凝胶电泳图
图4. PCR扩增获得全长基因的琼脂糖凝胶电泳图
具体实施例方式
材料和检测方法
(I)粘红酵母(Rhodotorula glutinis JN-1) (CCTCC NO :M2011490)，江南大学工业生物技术教育部重点实验室筛选。
(2)反转录试剂盒购自美国clontech公司。
(3)pfu酶，Taq酶，和pUCm-T，引物，均购自上海生物工程有限公司。
(4)测序由上海生物工程有限公司完成。
(5)采用Invitrogen软件拼接序列和分析阅读框。
实施例1
挑取粘红酵母单菌落至5mL的种子培养基中于30°C培养24h后，取50 μ L的种子液至装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30°C培养至OD6tltl =1. 0，离心收集菌体，采用TES 裂解细胞，酸性酚和氯仿提取总RNA，-80°C保藏备用，采用琼脂糖电泳检测总RNA质量。
实施例2
经琼脂糖凝胶电泳检测,提取高质量的RNA,加入反转录酶和反应缓冲液，42°C反应 90min，70°C 处理 lOmin，加入 20μ L 无菌水，获得 cDNA。以 5' -CTAATACGACTCACTATAGGGC AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAG T-3/ ；5/ -CTA ATACGACTCACTA TAGGGC-3' ；5/ -GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3 '为引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，切胶回收目的条带，加入Taq酶，700C反应30min后酚仿抽提，与pUCm_T连接，连接产物转入E. coli JM109,提质粒进行测序,获得5'端的序列。
实施例3
根据基因的5 '端序列，以 5 ' -GGAATTCCATATGATGGCCCCCTCCGTCGACTCGATC-3 ' 和5 ' -CGGAATTCC TAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3 '弓I物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物。PCR产物中加入Taq酶，70°C反应30min后酚仿抽提，与pUCm_T 连接，连接产物转入E. coli JM109,提质粒进行PCR验证，测序，构建pUCm-T-pal，利用 Invitrogen软件拼接序`列和分析阅读框。
权利要求
1.一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因(pal)序列获取方法；
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，苯丙氨酸脱氨酶基因(pal)来自粘红酵母 (Rhodotorula glutinis JN-1)(保藏编号 CCTCC NO M2011490)；
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，采用酸性酚法提取粘红酵母总RNA；
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，采用SMARTerIIA Oligonucleotide(5 ' -AAGCAGT GGTAT CAACGCAGAGTACGGGGG-3 ')和 CDS 引物 5’ -(T)25VN (N = A，C，G, T ；V = A, G，C)_3’ 进行反转录；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用Mix引物(longprimer 5 ' -CTAATACGACTCACTATAGG GCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 ' ;Short primer 5' -CTAATACGACTCACTATAG GGC-3')和特异性引物 GSP(IOyM) 5/ -GGTGATGCCGTGGTTGAG GAAGTT-3'，进行 PCR 扩增，获取pal的5'端的一段基因序列；
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增条件是94°C预变性4min，94°C变性 lmin, 58°C退火 30sec, 72°C延伸 2min, 25 个循环；
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，构建pUCm-T-pal克隆载体，转入 E. coliJM109，含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB平板上挑取单菌落培养，提取质粒，测序，获取全长的pal序列；
8.如权利要求2所述的方法，培养粘红酵母的种子培养基为1%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%氯化钠(pH6.0);诱导产苯丙氨酸脱氨酶培养基为在种子培养中加入O. 1%的 L-phe ；
9.权利要求7所述的方法，用于培养E.coliJM109的LB培养基为1%胰蛋白胨，O. 5% 酵母抽提物，I %氯化钠(PH7. O)。
全文摘要
本发明公开一种获取粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因的方法，经过提取RNA，反转录，PCR扩增，构建克隆载体pUCm-T-pal，测序，获得全长的苯丙氨酸脱氨酶基因序列，属于基因克隆技术领域。本发明方法操作简单，具有较高的效率和成功率。
文档编号C12N15/60GK103060352SQ20121034515
公开日2013年4月24日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者周哲敏, 朱龙宝, 崔文璟, 周丽, 曲娟娟 申请人:江南大学