专利名称：一株耐酸耐高温的酿酒酵母及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株 耐酸耐高温的酿酒酵母及其应用。
背景技术：
活性酵母菌是一种益生菌类微生态制剂。酵母属于兼性厌氧菌，在进入动物胃肠道后，消耗胃肠道的氧气，造成厌氧环境，从而促进有益菌群的繁殖，改善动物消化道微生态平衡，提高动物生产性能。同时，酵母菌在发酵过程中产酸，可促进饲料的消化，并进一步抑制有害菌群的繁殖。酵母菌耐酸的特性以及具有较宽的PH值适应范围的特性是在动物体内消化道起作用的前提，因此耐酸酵母菌在饲用酵母的应用上占优势。由于饲料加工过程中往往需要高温制粒，选育耐高温酵母菌对于在饲料工业中应用活性干酵母类产品是非常有意义的。除此之外，酵母细胞中含有大量水分、有机物和矿物质。其中含16种氨基酸、14种或更多的矿物质、17种维生素及硒、铬、铁、锌等微量元素，其中有机质占细胞干重的90-94%，蛋白质含量占细胞干重的30-50%。糖是酵母细胞壁的组成成分，含量在35-60%之间，主要为酵母多糖，即甘露寡糖和葡聚糖，可对细菌、病毒引起的疾病及环境因素引起的应激反应产生非特异性免疫力。脂类物质的含量在1_5%。酵母细胞中还富含各种消化酶，能促进动物体各种营养物质的消化吸收。此外酵母细胞还含有多种色素和未知的生长因子，是养殖动物的一种很好的营养源。目前，在饲用酵母研究方面，对具有耐酸耐高温特性的酵母菌株的筛选和鉴定以及发酵培养条件的研究，还未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Sa-IO0本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa_10在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏登记号为CGMCC No. 6120。该酿酒酵母具有耐酸耐高温特性，表现为I)在40°C培养时的生物量以菌体湿重计为44. 70g/L，明显高于对照YSF5的
21.30g/L ；2)在70°C热水浴处理15S时存活率为88. 1% ；3)在pH值为3. 5时的生物量以菌体湿重计为35. 40g/L,是对照YSF5的I. 5倍。本发明的另一个目的是提供一种酿酒酵母制剂，所述制剂的活性成分为所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Sa_10o本发明还提供一种酿酒酵母制剂的制备方法，包括用所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa_10进行液体发酵后，收集发酵液,再用所述发酵液进行固体发酵，收集所有固体发酵的产物烘干，获得所述酿酒酵母制剂。在上述方法中，所述用所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Sa-IO进行液体发酵包括将所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Sa-IO接种于种子培养基中，30200转/分钟振摇培养16 18小时，获得种子液；再将所述种子液按照体积比1:10的量接种于发酵培养基A中进行第一次液体发酵培养，再加入发酵培养基B进行第二次液体发酵培养，收集发酵液；所述发酵培养基A和所述发酵培养基B的溶剂为水，溶质由碳源、氮源和无机盐组成；所述碳源为糖蜜，所述糖蜜按糖浓度计在所述发酵培养基A中的浓度为15g/L ;所述糖蜜按糖浓度计在所述发酵培养基B中的浓度为240g/L ；所述氮源为尿素和玉米浆；所述尿素和所述玉米浆在所述发酵培养基A中的浓度分别为O. 56g/L和O. 19mL/L ;所述尿素和所述玉米浆在所述发酵培养基B中的浓度分别为12g/L 和 4mL/L ；所述无机盐为硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾，所述硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾在所述发酵培养基A中的浓度分别为lg/L、0. lg/L和lg/L ;所述硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾在所述发酵培养基B中的浓度分别为lg/L、0. lg/L和lg/L ；所述发酵培养基A和所述发酵培养基B的pH值为6. 5。在上述方法中，所述固体发酵是将所述发酵液按照每I. 4升所述发酵液与I千克质量比为72:18:10的玉米芯粉、玉米粉和豆柏粉的混合物混合后进行的。在上述方法中，所述第一次液体发酵的时间为4一5小时，所述第二次液体发酵的时间为21 — 22小时；所述加入发酵培养基B的量为所述发酵培养基A体积的1/3—2/5，所述加入发酵培养基B的方式为连续匀速加入5小时。在上述方法中，所述液体发酵的发酵条件为温度为30°C，转速为300— 800转/分钟，通气量为5 — 30L/分钟(根据发酵罐大小不同而不同)；
和/或，所述固体发酵的发酵条件为温度为30°C—45°C，时间为48小时。在上述方法中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的浓度分别为葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L和蛋白胨20g/L。本发明保护上述任一所述方法制备得到的酿酒酵母制剂。本发明保护所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa_10及所述酿酒酵母制剂的下述至少一种用途I)提高动物的采食量；2)提高动物体重的增加量；3)制备降低动物腹泻指数的产品；4)制备提高动物生产性能的产品。本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa_10及其制剂可以作为添加剂用于动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、羊、牛、鸡等各种动物。实验证明，与对照相比，本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa-IO制剂添加到断奶仔猪的基础日粮中，可明显提高断奶仔猪的日采食量、日增重，并降低腹湾指数。本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa_10在制备动物饲料添加剂或改善动物生产性能方面具有重要意义和广阔的应用前景。
保藏说明菌种名称酿酒酵母拉丁名Saccharomycescerevisiae菌株编号Sa_10保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2012年5月18日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 6120
图I为菌株Sa-IO和YSF5基因组DNA的PCR鉴定电泳图。其中，从左至右的泳道分别为分子量标准(从上到下的条带依次为5000、3000、2000、1500、1000、800、500、200bp)、菌株 Sa-IO 和 YSF5。图2为菌株Sa-IO基因组DNA的ITS1-5. 8S-ITS2保守区测序及比较结果。其中，Sa-10 ITS1-5. 8S-ITS2代表Sa-IO的基因组DNA，464282-465093. seq代表已公布的酿酒酵母的基因组DNA (Genbank号EF457559), Consensus代表相同的序列。图3为菌株Sa-IO在7L发酵罐中调控不同发酵液pH值的实验结果。其中，三角形表示自然PH值，正方形表示调控pH值为5. 0，菱形表示调控pH值为5. 5，圆形表示调控PH值为6. 0，长方形表示调控pH值为6. 5 ;上升的曲线表示生物量变化趋势，下降的曲线表示残糖量变化趋势。图4为菌株Sa-IO在7L发酵罐中调控不同流加速度的实验结果。其中，曲线表示残糖变化趋势，三角形代表流加速度为150毫升/小时、正方形代表200毫升/小时、菱形代表250毫升/小时、圆形代表300毫升/小时；柱形图表示生物量变化趋势，白框代表150晕升/小时，浅灰代表200晕升/小时、中灰代表250晕升/小时，黑柱代表300晕升/小时。图5为菌株Sa-IO在7L发酵罐中调控流加培养基中碳氮比的实验结果。其中，曲线表示残糖变化趋势，三角形代表碳氮比10、正方形代表碳氮比15、菱形代表碳氮比20、圆形代表碳氮比25 ;柱形图表示生物量变化趋势，白框代表碳氮比10，浅灰代表碳氮比15、中灰代表碳氮比20，黑柱代表碳氮比25。图6为菌株Sa-IO在7L发酵罐中调控流加培养基流加时间的实验结果。其中，曲线表示残糖变化趋势，三角形代表流加时间为5小时、正方形代表流加时间为6小时、菱形代表流加时间为7小时；柱形图表示生物量变化趋势，白框代表流加时间为5小时，中灰代表流加时间为6小时，黑柱代表流加时间为7小时。图7为菌株Sa-IO在20L发酵罐中不同发酵方案的实验结果。其中，曲线表示残糖变化趋势，三角形代表发酵方案I、正方形代表发酵方案II、菱形代表发酵方案III ;柱形图表示生物量变化趋势，白框代表发酵方案I，中灰代表发酵方案II，黑柱代表发酵方案III。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF5 :在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的编号为2. 1042。糖蜜是制糖工业的副产品，一种粘稠、黑褐色、呈半流动的物体，其中主要含有大量可发酵糖，是很好的发酵原料。下述实施例中糖蜜购自海南环球糖蜜食品实业有限公司，含糖量为450g/L。
玉米浆是制玉米淀粉的副产物，即将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩制成黄褐色的液体为玉米浆。下述实施例中玉米浆购自德州福源生物淀粉有限公司。玉米芯粉将玉米穗脱粒后的玉米芯加工制成的平均粒径为O. 25mm的小颗粒，含水量为5. 5%。玉米粉是将成熟的玉米粒加工制成的平均粒径为O. 18mm的小颗粒，含水量为13%。豆柏粉是大豆提取豆油后得到的一种副产品。下述实施例中豆柏粉购自邦基集团。糖蜜液体培养基(I升)取88. 9ml含糖量为450g/L的糖蜜，加入800ml自来水，煮沸处理15分钟，自然冷却，8000r/min条件下离心10分钟，取上清液作为培养基的成分，添加玉米衆8ml,氯化韩3g和磷酸二氢钠2g, pH为5. O 7. O。YEPD液体培养基溶剂为水，溶质为葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母粉10g/L。YEPD固体培养基为每升上述YEH)液体培养基中添加IOg琼脂获得的固体培养基。下述实施例中的溶氧量或溶氧为相对于如下溶氧量的百分比即开始接种前将通气量调至10L/min,搅拌为400r/min,维持IOmin时的溶氧量。下述实施例中的残糖量或残糖中的“％”代表每100毫升发酵液中含糖的克数。实施例I、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的筛选分离与鉴定I、菌株的分离纯化取适量的无核白葡萄皮于YEH)液体培养基中培养，30°C、200rpm摇床培养24 48h，将培养液稀释成如下三种浓度梯度10_\10_2、10_3后，分别涂布于YEro固体培养基平板上，每个梯度各两至三板。30°C培养24 48h，观察生长出的菌落形态，将符合酵母菌菌落形态的单菌落挑选出接至YEro斜面进行培养。在平板上可以观察到两种单菌落大菌落和小菌落，均为表面光滑，乳白色菌落。分别从大菌落和小菌落中接菌至YEro斜面上，30°C培养24h。显微镜观察细胞形态(16 X 40倍)，发现从小菌落接出的菌株细胞个体较小，约为正常酵母细胞的四分之一左右，形状为圆形或椭圆形，多数为单个菌体；从大菌落接出的菌株细胞个体较大，为正常酵母细胞大小，形状为圆形或椭圆形，有明显的出芽生殖。根据上述菌落形态和细胞形态的观察结果，初步认为从大菌落接出的11株菌为酵母菌株，编号为Sa-I Sa-II。2、细胞生物量测定将步骤I从大菌落接出的11株菌分别接种到装有5ml YEPD液体培养基的大试管中，30°C，200rpm摇床培养18 20h，再分别倒入装有50ml YEPD液体培养基的三角瓶中，30°C、200rpm摇床培养20 24h, 8000r/min离心5min收集各瓶中的菌体,分别称重,计算
生物量。3、PCR 鉴定从步骤2中挑选一个生物量最高的菌株Sa-10,以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YSF5作为对照，分别提取基因组DNA，再分别以这两株菌的基因组DNA为模板，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的序列保守区ITS1-5. 8S-ITS2为祀序列用引物I和引物2进行PCR扩增，将PCR产物进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳(结果如图I所示)，并进行测序和序列相似性分析(结果如图2所示)。上述PCR扩增的引物序列如下引物I :ITS1 :5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’引物2 :ITS4 :5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，结果菌株Sa-IO和YSF5的PCR扩增产物测序结果相同，与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 ITS1-5. 8S-ITS2 序列相似性为 99. 50%。4、API试剂盒鉴定将菌株Sa-IO和YSF5用API20 C AUX V3. O试剂盒(生物梅里埃中国有限公司)进行测定，结果二者均为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。菌株Sa-IO已于2012年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，分类名称为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),保藏编号为 CGMCC No. 6120。在YEro固体平板培养基中培养菌落形态为圆形，表面光滑，较大，呈乳白色，没有假菌丝。具有一定的耐酸碱和耐高温的能力。Sa-IO能利用的碳源有葡萄糖，半乳糖，甲基-α -葡萄糖甙，麦芽糖，蔗糖，海藻糖和棉子糖，不能利用的碳源有甘油，2-酮基-葡萄糖酸钙，阿拉伯糖，木糖，侧金盏花醇，木糖醇，肌醇，山梨醇，N-乙酰-葡萄糖胺，纤维二糖，乳糖和松三糖。实施例2、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Sa-10 CGMCC No. 6120 的生物学特性I、耐高温特性I)不同培养温度下的生物量分别将菌株Sa-IO和YSF5接种到装有5ml YEPD液体培养基的大试管中，30°C、200rpm摇床培养18 20h ;无菌条件下分别转接入装有50ml糖蜜液体培养基的250ml三角瓶中，分别在30°C、35°C和40°C下、200rpm摇床培养24h，每个温度做三瓶平行样，测生物量(每升培养液中的菌体湿重，g/L)，结果如表I所示。结果表明，与普通的酿酒酵母YSF5相比，该菌株Sa-IO在40°C培养时仍然保持较高的生物量。表I.菌株Sa-IO和YSF5在不同培养温度下的生物量(菌体湿重，g/L)
权利要求
1.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) Sa_10,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No. 6120。
2.一种酿酒酵母制剂，其特征在于所述制剂的活性成分为权利要求I所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Sa-10。
3.—种酿酒酵母制剂的制备方法,包括用权利要求I所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Sa-10进行液体发酵后，收集发酵液，再用所述发酵液进行固体发酵，收集所有固体发酵的产物烘干，获得所述酿酒酵母制剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述用权利要求I所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Sa-ΙΟ进行液体发酵包括将权利要求I所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Sa-IO接种于种子培养基中，30°C >200转/分钟振摇培养16 18小时，获得种子液；再将所述种子液按照体积比1:10的量接种于发酵培养基A中进行第一次液体发酵，再加入发酵培养基B进行第二次液体发酵，收集发酵液； 所述发酵培养基A和所述发酵培养基B的溶剂为水，溶质由碳源、氮源和无机盐组成； 所述碳源为糖蜜，所述糖蜜按糖浓度计在所述发酵培养基A中的浓度为15g/L ;所述糖蜜按糖浓度计在所述发酵培养基B中的浓度为240g/L ； 所述氮源为尿素和玉米浆；所述尿素和所述玉米浆在所述发酵培养基A中的浓度分别为O. 56g/L和O. 19mL/L ;所述尿素和所述玉米浆在所述发酵培养基B中的浓度分别为12g/L 和 4mL/L ； 所述无机盐为硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾，所述硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾在所述发酵培养基A中的浓度分别为lg/L、0. lg/L和lg/L ;所述硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾在所述发酵培养基B中的浓度分别为lg/L、0. lg/L和lg/L ； 所述发酵培养基A和所述发酵培养基B的pH值为6. 5。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述固体发酵是将所述发酵液按照每I. 4升所述发酵液与I千克质量比为72:18:10的玉米芯粉、玉米粉和豆柏粉的混合物混合后进行的。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于所述第一次液体发酵的时间为4—5小时，所述第二次液体发酵的时间为21 — 22小时； 所述加入发酵培养基B的体积为所述发酵培养基A体积的1/3—2/5，所述加入发酵培养基B的方式为连续匀速加入5-6小时。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述液体发酵的发酵条件为温度为30°C，转速为300— 800转/分钟，通气量为5 — 30升/分钟； 和/或，所述固体发酵的发酵条件为温度为30 45°C，时间为48小时。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的浓度分别为葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L和蛋白胨20g/L。
9.权利要求3-8中任一所述方法制备得到的酿酒酵母制剂。
10.权利要求I所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Sa_10、权利要求2和9所述制剂的下述至少一种用途 1)提高动物的采食量； 2)提高动物体重的增加量；3)制备降低动物腹泻指数的产品；4) 制备提高动物生产性能的产品。
全文摘要
本发明公开了一株耐酸耐高温的酿酒酵母及其应用。所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa-10，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.6120。利用本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa-10制剂添加到断奶仔猪的基础日粮中，可明显提高断奶仔猪的日采食量、日增重，并降低腹泻指数。本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sa-10在制备动物饲料添加剂或改善动物生产性能方面具有重要意义和广阔的应用前景。
文档编号C12R1/865GK102936572SQ20121034963
公开日2013年2月20日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者任泽林, 王宏, 李慧, 余际国, 明艳超, 黄吉波, 杨晓峰, 张丙仁 申请人:北京英惠尔生物技术有限公司