专利名称：一种小红酵母及其分离培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小红酵母及其分离培养方法与应用。
背景技术：
小红酵母是环境真菌，少数种类为致病菌，可引起免疫抑制患者系统性感染(Thanos L,Mylona S，Kokkinaki A,Pomoni M, Tsiouris S，Batakis N. Multifocalskeletal tuberculosis with Rhodotorula minuta co-infection. Scand J InfectDis. 2006; 38 (4) :309-11.)。人类甲真菌病是由致病性真菌引起的甲板和甲下组织的真菌感染。甲真菌病主要由表皮癣菌如红色毛癣菌、须癣毛癣菌等，少数由酵母菌及非皮肤癣菌的丝状真菌引起。为一常见病，多发病。目前，临床将甲真菌病分为5种类型浅表白甲型(superficial white onychomycosis)、远端侧位甲下型(distal and lateral subungual onychomycosis)、近端甲下型(proximal subungual onychomycosis)、甲内型(endonyx onychomycosis)和全甲毁损型(total distropic onychomycosis)。糖尿病、免疫受损患者及正常人群菌可发生此病。目前尚无文献报道分离成功可引起人类甲真菌病的小红酵母，以及对该类小红酵母的流行病学和致病机制的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于分离培养纯化一株新的可致人类甲真菌病的小红酵母(Rhodotorula minuta)菌株,并提供其分离培养纯化方法，以及该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。本发明提供了一株小红酵母(Rhodotorula minuta),已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jias :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 6019。该菌株是于2011年长征医院皮肤科在一名15岁免疫正常女性患者甲真菌病病甲中分离所得，经ITS测序和API 20C酵母鉴定试剂盒证实为小红酵母。本发明的小红酵母(Rhodotorula minuta)菌株CGMCC No. 6019属担子菌门(Basidiomycota),担抱目(Sporidiales),红酵母属(Rhodotorula)。I.形态特征病甲用10%K0H处理后于光镜下可见小的、椭圆形酵母，3. 5-6. 5X3. 5 μ m。2.培养特征该菌可在麦芽浸出培养基(MEA ；0xoid, Basingstoke, UK)上25°C培养时表现为粉红色、光滑菌落，边界清楚。3.碳源利用可同化葡萄糖、蔗糖、甘油、琥珀酸盐。尿素试验阳性。
所述小红酵母ITS1、5. 8S rDNA和ITS2区扩增测序方法采用真菌通用引物上游引物ITS5:5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);下游引物ITS4:5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID N0:2 所示)。以基因组扩增，PCR反应体系 50μ L :10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 混合物8yL，10umol/L引物各lul，模板2ul，Taq酶O. 5ul，无菌水32. 5 μ L。PCR扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性I分钟，55°C退火I分钟，70°C延伸2分钟，30个循环；72°C保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730DNA自动测序仪双向测序两次。测序结果如SEQID NO: 3所示；将测序结果于NCBI网站讲行序列比对(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast, cgi),同小红酵母CBS4407比同源性99%。本发明还提供了所述的小红酵母的分离培养纯化方法，该方法包括 小红酵母接种于沙氏琼脂培养基平板，25°C，第3天生长，得到小红酵母菌落；该方法还包括培养和保存步骤从-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取I接种环菌液接入新鲜沙氏斜面培养基上；保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEH)液体培养基中_70°C冻存。所述的沙氏斜面培养基的组分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121。。10分钟灭菌后备用；所述的酵母浸出膏蛋白胨(YEPD)液体培养基的组分和重量百分比如下1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。本发明还提供了该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。所述的抗真菌药物具体为抗人类甲真菌病药物。参照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.Approved standard M27-A3. Wayne, PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.),该小红酵母对两性霉素b、氟胞喃唳、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的药物敏感性进行测定。其MIC值分别为〈0.5、〈4、16、〈0. 125、〈 μ8/ιΛ。本发明的小红酵母可用于筛选新的抗真菌药物。
图I是本发明小红酵母的KOH镜检图；图2是本发明小红酵母的甲病理图(PAS染色)。微生物保藏信息小红酵母(LWQ2010,),分类命名小红酵母Rhodotorulaminuta，已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No. 6019。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例I :小红酵母(Rhodotorula minuta)菌株 CGMCC No. 6019
小红酵母(LWQ2010,),分类命名小红酵母Rhodotorula minuta,属担子菌门(Basidiomycota),担抱目(Sporidiales),红酵母属(Rhodotorula)。本发明的菌株由上海长征医院皮肤科于甲真菌病患者病甲中分离和检测鉴定。于2012年4月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为 CGMCCN0. 6019。I.形态特征病甲用10%K0H处理后于光镜下可见小的、椭圆形酵母，3. 5-6. 5X3. 5μπι，如图I、图2所示。2.培养特征该菌可在麦芽浸出培养基(MEA ；0xoid, Basingstoke, UK)上25°C培养时表现为粉 红色、光滑菌落，边界清楚。3.碳源利用试验方法参见工具书廖万清等主编《真菌病学》，人民卫生出版社，1989年。可同化葡萄糖、蔗糖、甘油、琥珀酸盐。尿素试验阳性。4.菌株的分离培养及保存技术本发明的小红酵母的菌种分离纯化技术包括小红酵母接种于沙氏琼脂培养基平板(25°C)，第3天生长，得到小红酵母菌落。所述小红酵母的斜面培养和保存技术包括从-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取I接种环菌液接入新鲜沙氏斜面培养基上。沙氏培养基配方葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121°C 10分钟灭菌后备用。保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEro液体培养基中-70°c冻存。YEro液体培养基配方ι%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。5.真菌鉴定技术所述小红酵母ITS1、5. 8S rDNA和ITS2区扩增测序方法采用真菌通用引物上游引物ITS5 :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);下游引物ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID NO:2 所示)。以基因组扩增，PCR反应体系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 混合物8yL，10umol/L引物各lul，模板2ul，Taq酶0. 5ul，无菌水32. 5 μ L。PCR扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性I分钟，55°C退火I分钟，70°C延伸2分钟，30个循环；72°C保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730DNA自动测序仪双向测序两次。测序结果GGGATTTTGCGTCTGATGATTTGAGATCTAAGCTTAAGTGCTATAAAGCGCATTAGAAGCACCTCTTATATTTGAAGAAGACGTCCTTAGCGAAATAATTATTACGCCAAGTCAAACCGTCTATTTCAATAGGGTTGCTCGTGTATTTCAGTTGAGCCGGCAATTACGCCGACAGACAACCATAATCCAAGCCCACGCCCATTTCATTACAAAATAGGGGGGTTGAGAGTTTCATGATACTCAAACAGACATACTCTTCGGAATACCAAAGAGTGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTTTATTTTTGTTTATGCTCAATTAAGAGACTATTACATTCTTATACTAATGTGTTAAAAGTGTGTGTAAAAAGAAGTGTGTGCACAGTGTAAGAAAATGAAATGGTCGGACTTCTAAAAAGAACGTCCTAAAATTCATTAATGATCCTTCCGCAGGTTGACCTACGGAAACCT.(如 SEQ ID NO: 3 所示)；将测序结果于 NCBI 网站进行序歹丨J 比对(http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi ),同小红酵母 CBS4407 比同源f生99%。实施例2 :真菌药敏实验参照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.Approved standard M27-A3. Wayne, PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.),该小红酵母 对两性霉素b、氟胞喃唳、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的药物敏感性进行测定。其MIC值分别为〈O. 5、〈4、16、〈O. 125、〈1μ g/mL。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
权利要求
1.一株小红酵母(Rhodotorula minuta),保藏编号为 CGMCC No. 6019。
2.根据权利要求I所述的小红酵母的分离培养纯化方法，其特征在于，该方法包括 小红酵母接种于沙氏琼脂培养基平板，25°C，第3天生长，得到小红酵母菌落。
3.根据权利要求I或2所述的小红酵母的分离培养纯化方法，其特征在于，该方法包括培养和保存步骤如下从-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取I接种环菌液接入沙氏斜面培养基上；保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱保存或放入含有25%甘油的酵母浸出膏蛋白胨液体培养基中_70°C冻存； 所述的沙氏斜面培养基的组分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121 °C 10分钟灭菌后备用； 所述的酵母浸出膏蛋白胨液体培养基的组分和重量百分比如下1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
4.一种如权利要求I所述的小红酵母在筛选抗真菌药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的小红酵母在筛选抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述的抗真菌药物为抗人类甲真菌病药物。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小红酵母及其分离培养方法与应用。本发明的目的在于分离培养纯化一株新的可致人类甲真菌病的小红酵母菌株，本发明提供了一株小红酵母(Rhodotorula minuta)，已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6019。本发明对该菌株的形态特征、培养特征、碳源利用作了进一步研究。本发明还提供了该菌株的分离培养纯化方法，以及在筛选抗真菌药物中的应用。
文档编号C12N1/02GK102864085SQ20121035182
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者廖万清, 潘炜华 申请人:中国人民解放军第二军医大学