专利名称：一种卵巢透明细胞癌诊断试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种利用HNFlB荧光探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒，还涉及HNFlB荧光探针的制备方法，本发明的HNFlB荧光探针及相应的试剂盒可用于卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案选择。
背景技术：
卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖器官常见的肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌的病因尚不清楚，其发病可能与年龄、生育、血型、精神因素及环境等有关。卵巢癌临床早期无症状，鉴别其组织类型及良恶性相当困难，目前为止，临床资料统计 五年生存率仅25% 30%。卵巢癌是相对常见的病，大约有1. 4%的女性会患上这种病。发现早，90 %的病人都能活下来；发现迟，癌细胞扩散到卵巢，存活率低于30 %。卵巢透明细胞癌(Ovarian clear cell carcinoma, OCCA)占卵巢癌的5% 11 %,发病平均年龄58岁，与子宫内膜异位症的关系密切，在病变的卵巢中合并子宫内膜异位症达24%左右，而同时存在盆腔子宫内膜异位症病变的达25% 50%左右，这在其他卵巢上皮性癌中是少见的。卵巢透明细胞癌为恶性肿瘤，预后较其它分型更差，与临床分期有密切关系。卵巢癌检查有几种方法，包括细胞学诊断、超声波检查、免疫学检查等，但均不十分成功。目前而言，卵巢恶性肿瘤标志物的敏感性和特异性均不能满足早期诊断的需要，多用来检测治疗中和/或治疗后的病情变化，为评定疗效和及时发现肿瘤复发提供依据。肝细胞核因子-1 (HNFI homeobox B, HNF1B)位于17号染色体长臂I区2带，编码一种包含同源结构域的转录因子超家族成员，编码蛋白与DNA结合形成同源二聚体，或与 HNFla (hepatocyte nuclear factor1-alpha)结合形成异质二聚体。转录因子 HNFlB对胰腺细胞形成和维持血糖稳态具有重要作用。基因突变会导致肾囊肿和非胰岛素依赖型糖尿病或称为第二型糖尿病，在一些癌症中该基因的表达会发生改变。目前有研究表明，HNFlB是卵巢透明细胞癌的生物标志物，可有效区分透明细胞癌与其它病变类型。临床研究中通过RNA干扰该基因表达，能达到细胞凋亡目的，使该基因在治疗方面有广阔的应用前景。[Jin L, et al. Regulation of tissue-specific expression of renal organicanion transporters by hepatocyte nuclear factor I a /β and DNA methylation.JPharmacol Exp Ther, 2012Mar ;Stanislas Faguer, et al. Diagnosis, management, andprognosis ofHNFIB nephropathy in adulthood. Kidney International80,768-776 ;Berndt SI,Sampson J,Yeager M,et al. Large-scale fine mapping of the HNFlB locusand prostate cancer risk.Hum Mol Genet.201IAug 15 ；20 (16) :3322-9 ;Brimo F,Herawi M, Sharma R, et al. Hepatocyte nuclear factor-1β expression in clear celladenocarcinomas of the bladder and urethra diagnostic utility and implicationsfor histogenesis. Kim HJ, Bae JS, Lee J, et. al. HNFlBpolymorphism associatedwith development of prostate cancer in Korean patients. Hum Pathol. 201INov ；42(11) :1613-9. Urology. 201IOct ；78 (4) :969. el_6 ;Sohei Yamamoto，Hitoshi Tsuda，Shinsuke Aida, et, al.1mmunohistochemical detection of hepatocyte nuclearfactor
Iβ in ovarian and endometrial clear-cell adenocarcinomas and nonneoplasticendometrium. Human Pathology Vol. 38.1ssue 7，1074—1080 ；K. Yamaguchi，M. Mandai，T. Oura，N. Matsumura，J. Hamanishi and T. Baba et al.，Identification of an ovarianclear cell carcinoma gene signature that reflects inherent disease biology andthe carcinogenic processes, Oncogene 29(2010), pp.1741-1752.]目前试验室检测方法常见的有基于免疫组化的表达分析和基于荧光定量PCR方法(FQ-PCR)或测序技术的突变及缺失分析。[Harries LW, Brown JE, Gloyn AL(2009)Species-Specific Differences in the Expression of the HNF1A， HNFlBandHNF4AGenes. PLoSONE 4(11) e7855 ；Immunohistochemical detection of hepatocytenuclearfactor I β in ovarian and endometrial clear-cell adenocarcinomas andnonneoplastic endometrium. Human Pathology Vol. 38,Issue 7，1074-1080] 综上，HNFlB因其在卵巢透明细胞癌中的特异表达特征，有望作为肿瘤鉴别分型和靶向治疗的新靶标。但该基因的检测方法目前仅停留在试验室阶段，市场无灵敏度高、特异性好的检测试剂。荧光原位杂交技术基于碱基互补原则，用已知序列标记DNA探针与载玻片上的待测DNA/RNA互补杂交，在荧光显微镜下检测杂交信号判断结果。FISH技术将细胞遗传学和分子生物学改变联系起来，让微小的基因改变显现于肉眼之下，拓展了细胞遗传学检测的范围，显著提高了其识别异常染色体的能力。目前已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等检测。本发明利用荧光原位杂交技术，以HNFlB基因区段为靶标，设计并制备荧光探针。利用探针实现对HNFlB基因状态的检测，有助于卵巢透明细胞癌鉴别分型和治疗方案制定，从而达到早鉴别早治疗，提高诊疗效果。本发明提供了一种卵巢透明细胞癌分子标志物HNFlB探针的制备方法，并在此基础上利用探针自主研制了 HNFlB基因检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供HNFlB基因探针(GSP HNF1B)和作为内控的用于17号染色体鉴别的17号染色体着丝粒探针(CSP17)的制备方法。根据本发明一个优选的实施方案，GSP HNFlB的制备步骤包括(I)克隆筛选通过NCBI Mapview数据库检索所有含有HNFlB (17ql2)基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。(2)克隆培养和鉴定按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆，取100 μ I克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37°C摇床中摇菌培养8 12小时；针对HNFlB基因探针使用相应的STS弓丨物进行PCR扩增，并通过2 %琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。(3)基因探针制备对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；获得探针，避光、-20±5°C储存。(4)基因探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。根据本发明一个优选的实施方案，CSP17的制备步骤包括(I)片段分析通过NCBI Mapview数据库检索重复区域序列，进行重复性分析。(2)引物设计针对重复片段,利用Primer Premier 5· O设计引物对。(3)克隆、培养和鉴定以人基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR反应。通过电泳进行鉴定；将目的产物进行克隆、培养，同样使用上述引物对进行PCR扩增，并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。(4)探针制备对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；获得探针，避光、-20±5°C储存。(5)探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有HNFlB基因最优选的克隆，编号为 CTD-2257N17(chrl7 :36033624. · 36152533)。根据本发明一个优选的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列为上游引物 5’-TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3’ (SEQ ID NO 1)和下游引物 5’-TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3’ (SEQ ID NO 2) ;PCR扩增条件为94°C 5 分钟；(94 °C 30 秒，56。。30 秒，72 0C 45 秒)X 35 循环；72°C 7 分钟。根据本发明一个优选的实施方案，用于制备CSP17探针的引物对序列为上游引物 5’-TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3’(SEQ ID NO 3)和下游引物 5’_AGTGITTCCAAACTGCTGAATC-3，(SEQ ID NO :4) ;PCR扩增条件为:94°C 5 分钟；(94°C 30秒，56°C 30 秒，72°C 45秒)X 35循环；72°C 7分钟。根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中克隆质粒DNA提取可使用市售的质粒提取试剂盒，优选Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中克隆质粒DNA的定量是将质粒DNA稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中质粒DNA进行荧光标记可以使用切口平移方法标记，利用DNaseI和DNA聚合酶I实现基因探针的荧光标记。根据本发明一个优选的实施方案，50 μ I切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在IOU 20U间，DNase I使用量在O. OOlU O. OlU间，标记条件为16°C 2小时。根据本发明一个优选的实施方案，探针标记的荧光素为荧光素标记的dUTP，并优选 Spectrum dUTP。根据本发明一个优选的实施方案，探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用I
2μ I灭菌纯化水或Human Cot-1DNA (I μ g/ μ I)溶解沉淀。本发明的另一个目的是利用HNFlB基因探针和CSP17探针(内控)制备一种用于辅助卵巢透明细胞癌鉴别分型和治疗选择的HNFlB基因荧光原位杂交检测试剂盒。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案(I)样本处理和制片按照原位杂交方法对样本进行处理。
(2)杂交配制杂交液，主要包括标记探针和杂交缓冲液。合适温度下进行8 16小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。(3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，对不同信号进行观察计数。基于以上技术方案发明的试剂盒包括1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA，DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSCjt酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50% 70%，硫酸葡聚糖浓度为O. lg/ml。根据本发明的一个优选实施方案，荧光标记探针混合物包括GSP HNFlB和CSP17探针，每人份荧光标记探针混合物中两种基因探针的使用量均为O. 5 μ I。
根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记探针混合物和未标记的竞争性DNA配制杂交液，其中未标记的竞争性DNA选择Human C0T-1DNA。每人份杂交液中加入7 μ I杂交缓冲液，I μ I荧光标记探针混合物，Human C0T-1DNA使用量为I μ g，并用H20 补至 10 μ I。根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50 250ng DAPI溶于Iml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS,甘油混合液)。利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行信号计数。本发明与现有技术相比，具有下列优点(I)实现了对卵巢透明细胞癌新分子标志物HNFlB基因状态的检测；(2)进行准确、快速的信号计数、且结果重复性好；(3)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞信号计数，操作相对简单；(4)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系。
图1显示GSPHNF1B克隆鉴定的电泳结果。目的产物223bps。其中I道为marker，2道为样本；箭头标示代表300bp。图2显示CSP17克隆鉴定的电泳结果。目的产物316bps。其中I道为marker，2道为样本；箭头标示代表300bp。图3显示人类外周血淋巴细胞中期染色体上GSP HNFlB (红色)和CSP17(绿色)检测结果。图4显示卵巢透明细胞癌组织样本中GSP HNFlB (红色)和CSP17 (绿色)的检测结果。其中箭头分别指示出两色探针的荧光信号。图5显示卵巢浆液性囊性癌组织样本中GSP HNFlB (红色)和CSP17 (绿色)的检测结果。其中箭头分别指示出两色探针的荧光信号。
图6显示HNFlB基因所在17ql2区段。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1:GSP HNFlB探针的制备(I)引物设计克隆筛选=HNFlB基因位于人染色体17ql2区段，NCBI Mapview数据库检索所有含有HNFlB基因的克隆，筛选出包含有该基因的克隆，编号为CTD-2257N17。(参见附图6)(2)克隆培养和鉴定购买克隆CTD-2257N17，取100 μ I克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37°C摇床中摇菌培养8 12小时；菌液使用上游引物5’ -TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3’ 和下游引物 5’ -TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3’ 进行 PCR扩增，扩增条件为94°C 5分钟；(94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒)X 35循环；72°C 7分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果在223bps具有明亮的条带(参见附图1)。(3)基因探针制备鉴定阳性的菌液,使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit,按照 说明书要求的操作方法进行质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式双链DNA浓度(ng/ μ I) = 0D260 X 50 (ng/ μ I)计算质粒DNA浓度。通过切口平移方法对质粒DNA进行突光标记，探针标记的突光素为SpectrumdUTP，选择orange-dUTP标记HNFlB基因。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。
组分加入量
IOxDNA聚合酶I buffer5 μ
0.5 mM dTTPI μ
I mM d3TPI μ
DNA聚合酶I lOU/μΙI μ
DNase I 0.001 U/μΙ5 μ
0.2 mM orange-dUTP2.5 μ
模板I Ag
水补足50μ1配完后震荡混匀，16°C标记2小时，再80°C孵育10分钟灭活酶。对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1. 5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制
标记产物45μ1
Human Cot-1 DNA5μ1
醋酸钠(3mol/L)5μ1
无水乙醇125μ1混匀后置于_80°C冰箱中2小时，4°C 12000rpm离心20分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入Iml的70%乙醇，4°C 12000转/分钟离心10分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用I μ I灭菌纯化水溶解沉淀，获得HNFlB基因探针，避光、_20°C储存。(4) HNFlB基因探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(10号染色体)上均可见荧光信号。
实施例2 CSP17着丝粒探针的制备(I)引物设计通过NCBI Mapview数据库检索重复区域序列，进行重复性分析，利用Primer Premier 5· O设计引物对。(2)克隆、培养和鉴定以人基因组DNA为模板，利用上游引物5’-TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3’ (SEQ ID NO :3)和下游引物5’-AGTGITTCCAMCTGCTGAATC-3进行PCR反应。扩增条件为94°C 5分钟；(94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒)X 35循环；72°C7分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果在316bps具有明亮的条带(参见附图2)。(3)探针制备鉴定阳性的菌液,使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit,按照说明书要求的操作方法进行质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式双链DNA浓度(ng/ μ I) = 0D260 X 50 (ng/ μ I)计算质粒DNA浓度。 通过切口平移方法对质粒DNA进行突光标记，探针标记的突光素为SpectrumdUTP，选择green-dUTP标记CSP17探针。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。
组分加入量
IO XDNA聚合酶I buffer5 μ
0.5 mM dTTP1.4μ1
I mM d3TPI μ
DNA聚合酶I lOU/μΙI μ
DNase I 0.001 U/μΙ3 μ
0.2 mM green-dUTP1.5 μ
模板I Kg
水补足50μ1配完后震荡混匀，16°C标记2小时，再80°C孵育10分钟灭活酶。对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1. 5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制
标记产物45μ1
Human Cot-1 DNA5μ1
醋酸钠(3mol/L)5μ1
无水乙醇125μ1混匀后置于_80°C冰箱中2小时，4°C 12000rpm离心20分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入Iml的70%乙醇，4°C 12000转/分钟离心10分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用I μ I灭菌纯化水溶解沉淀，获得HNFlB基因探针，避光、_20°C储存。(4)CSP17探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(17号染色体)上均可见荧光信号。实施例3 =HNFlB基因荧光原位杂交检测试剂盒制备以10人份/盒为例。(I)杂交液配制
将标记好的探针依次放好，按下表方案配制荧光标记探针混合物
权利要求
1.一种辅助卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案选择的HNFlB基因状态荧光原位杂交检测试剂盒，包括1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染齐U，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于荧光标记探针混合物包含GSPHNF1B探针和17号染色体着丝粒探针，每人份荧光标记探针混合物中GSP HNFlB和CSP17探针的使用量均为O. 5 μ I。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于未标记的竞争性DNA为HumanC0T-1DNA。
3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50% 70%，硫酸葡聚糖浓度为O. lg/ml。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于DAPI复染剂配制方法为50 250ngDAPI溶于Iml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS,甘油混合液)。
5.一种制备权利要求1试剂盒所述HNFlB基因探针和17号染色体着丝粒探针的方法，如下 (1)片段筛选通过NCBIMapview数据库检索所有含有HNFlB基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择含有HNFlB基因最优的克隆，编号为CTD-2257N17(chrl7 36033624. . 36152533);通过NCBI Mapview数据库检索17号染色体重复区域序列，并进行重复性分析，选择引物设计区域； (2)培养鉴定按照HNFlB筛选确定的克隆编号购买克隆(Invitrogen)，常规培养，使用针对HNFlB基因区域的STS引物进行PCR扩增，并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选HNFlB克隆的鉴定；CSP17以人基因组DNA为模板，利用设计的引物对进行PCR反应，通过电泳进行鉴定；将目的产物进行克隆、培养，从而完成待选CSP17片段鉴定； (3)探针制备对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化； (4)探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于包含HNFlB基因片段的克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列分别为上游引物5’ -TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3’和下游引物 5’ -TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3’ ；PCR 扩增条件为94°C 5 分钟；(94°C 30 秒，56 0C 30 秒，72 0C 45 秒)X 35 循环；72°C 7 分钟。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于制备CSP17探针的引物对序列为 上游引物5’ -TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3’ 和下游引物5，-AGTGTTTCCAAACTGCTGAATC-3’ ；PCR 扩增条件为94°C 5 分钟；(94°C 30 秒，56°C 30 秒，72 V 45 秒)X 35 循环；72°C 7 分钟。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针制备过程中50μ I切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在IOU 20U间，DNase I使用量在O. OOlU O. OlU间。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针标记的荧光素为荧光素标记Spectrum dUTP。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用I 2 μ I灭菌纯化水或Human Cot-1DNA (I μ g/ μ I)溶解沉淀。
全文摘要
本发明涉及一种利用HNF1B荧光探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒，还涉及HNF1B荧光探针的制备方法，本发明的HNF1B荧光探针及相应的试剂盒可用于卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案选择。
文档编号C12N15/10GK102994630SQ20121035788
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者李明, 何瑰, 陈华云 申请人:中山大学达安基因股份有限公司