专利名称：一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。
背景技术：
胰腺癌是常见的消化道肿瘤之一，据估计，全球2008年新发胰腺癌病例达27万。在我国，近20年来胰腺癌发病率增长了将近6倍，特别是在经济较发达的地区，胰腺癌的发病率已与西方国家持平。胰腺癌恶性程度高，预后极差，由于其特殊的生物学行为，即易于侵犯血管和神经，肿瘤很小时就发生远处转移，对常规化疗、放疗和免疫治疗等均不敏感等，我国的5年生存率仅为5%左右。近年来，随着胰腺癌发病率和死亡率的继续增高，胰腺癌已严重威胁着人类的健康和生命。
尽管胰腺癌高度恶性，但是如果能早期发现早期治疗，仍可获得最佳治疗效果，如早期胰腺癌手术切除率为90%-100%，5年生存率可达70%-100%，与进展期胰腺癌相比，两者治疗效果存在着巨大的反差。可是，由于胰腺解剖位置深在及胰腺癌的生物学特性，导致了胰腺癌早期诊断困难，大部分患者就诊时已处于晚期。目前对胰腺癌的生物学标志进行了大量而广泛的研究，包括基因标记、血清学标记和细胞学标记等，由于这些指标的特异性和敏感性各有差异，对于早期胰腺癌目前还没有准确有效的筛查方法，也缺乏可靠的诊断措施，鉴于此，胰腺癌早期诊断率亟待提高，寻找有效的标志物对胰腺癌早期诊断、促进其预后具有重要意义。MicroRNAs (即miRNAs)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点,它的成熟状态是一类长约19-23个核苷酸的小单链RNA分子，进化上具有高度保守性。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性，通过与靶mRNA的3'端非编码区结合，降解或者抑制mRNA的翻译导致靶基因的转录后沉默，从而调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。自从参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。2005年预测miRNAs至少能调控5300个人类基因，即所有基因的30%。随着研究的深入，越来越多的miRNAs不断被发现。聚光灯下的miRNA已经逐步摆脱了 DNA光芒的掩盖，从“配角”变成“主角”，并且对DNA的中心地位提出了新的挑战。近年来，miRNA与肿瘤的关系已经成为研究的热点和重点，已经发现miRNA通过负调控基因的表达与肺癌，乳腺癌，胃癌，胰腺癌等的发病高度相关。研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。血清/血浆miRNA作为肿瘤诊断和预后分子标志物不仅具有创伤小，方法准确、便捷的优势，而且还可改进疾病诊断、肿瘤分类、预后估计、疗效及复发预测的精度。但是，由于血清/血浆中miRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清/血浆miRNA在肿瘤临床检测中亟待解决的问题。另一方面，仅仅采用一种血清/血浆miRNA作为肿瘤标志物往往特异性不足，若将多种miRNA组合使用并与其他类型肿瘤标志物检测相结合，可有望显著提高诊断的准确性。然而，目前还没有用于胰腺癌诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出胰腺癌异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国胰腺癌的诊断现状必将是一次有力的推动。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物。本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物的引物。
本发明的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物及其引物在制备胰腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。本发明第四个目的是提供胰腺癌辅助诊断的试剂盒。发明人通过分离和研究胰腺癌患者及与其年龄、性别匹配的健康对照血清/血浆中miRNAs，寻找一组与胰腺癌高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于临床应用的胰腺癌诊断试剂盒，为胰腺癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为miR-451和miR-409-3p 的组合。所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，这些引物为miR-451 的引物为 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2 ;miR-409_3p 的引物为 SEQ IDNo. 3 和 SEQ ID No. 4。所述的血清/血浆miRNA标志物在制备胰腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。所述血清/血浆miRNA标志物的引物在制备胰腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。一种胰腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中miR-451和miR-409_3po所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有血清/血衆miRNA中miR-451和miR-409_3p的引物。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的血清/血浆miRNA标志物的引物为miR-451 的引物为 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2 ;miR-409_3p 的引物为 SEQ IDNo. 3 和 SEQ ID No. 4。所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2, DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。具体地说，本发明解决问题的技术方案包括(1)建立统一标准的标本库和数据库以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清/血浆miRNA差异表达谱分析选择胰腺癌病例、与胰腺癌病例年龄、性别匹配的健康人对照，检测其血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析胰腺癌病例和健康人对照间血清/血浆miRNA的共性和特性，筛选差异表达miRNAs，进行进一步单个样本验证，确定胰腺癌发病相关血清/血浆miRNAs (3)血清/血浆miRNA筛查和诊断试剂盒的研制根据胰腺癌病例和健康人对照的特异血清/血衆miRNA开发miRNAs诊断试剂盒。本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，并控制患者年龄和性别等因素对于发病的影响)，并米用了 RT-PCR、Real-time PCR 方法、TaqMan Low Density Array (TLDA)芯片检测等。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分I.研究样本的选择( I)经病理学明确诊断的胰腺癌病例(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗 (3)与病例年龄、性别匹配的健康人对照本研究共采用48例符合标准的样本进行研究。2. Trizol 试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司)提取血清/血浆总RNA，按常规方法操作。通常能得到 5 μ gRNA/50ml血清或血浆。3. TLDA (Applied Biosystems 公司)芯片检测(I)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品(2) cDNA样品进行预扩增反应(3 )预扩增产物进行TLDA芯片检测，得到miRNA的表达谱(4)数据分析与处理4. Real-time RT-PCR (qRT-PCR)方法(I)取受试者的血清/血衆总RNA,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；(2)设计引物；( 3)加入荧光探针或染料进行PCR反应；(4)检测并比较胰腺癌病例与健康人对照血清/血浆样本中miRNA的量的变化。5.诊断试剂盒制备方法TLDA芯片检测方法综合确定胰腺癌病例和健康人对照中有拷贝差异和表达差异，通过qRT-PCR技术筛选在胰腺癌病例和健康人对照中表达量和差异程度大的一组血清/血浆miRNA，作为胰腺癌辅助诊断的指标。最后筛选出的与胰腺癌发病有关的血清/血浆miRNA组成诊断试剂盒(miR-451和miR-409_3p)。诊断试剂盒可以包括这些血清/血衆微小核糖核酸组合的引物，探针，以及Taq酶、dNTP等试剂。6.统计分析方法运用X 2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征、组织类型和miRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。我们在24例胰腺癌病例和24例健康人对照中运用TLDA芯片的研究结果发现有6种miRNAs与胰腺癌发病情况有显著关联。个体miRNAs检测的不同表达水平以表示，其中ACt=CTtMi-CT_，我们在每一个样本提取时加入cel-mir-39的RNA作为参照，计算相对表达量。对有统计学显著差异的miRNAs在24例胰腺癌病例和24例对照中进行单个验证，进而观察本研究结果的稳定程度。
为了进一步研究这两种miRNAs构成的综合指征用于胰腺癌诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每种miRNA与胰腺癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，首先以健康人对照组miR-451、miR-409-3p表达量的单侧95%参考值范围为标准，分别将这2种miRNA的表达水平评为O分和I分，然后我们再以对照人群的回归系数为权重，综合考虑每种miRNA的表达情况给每个病人确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下:危险分值=(5. 771XmiR-451的评分)+ (3. 243XmiR-409_3p的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于48例样本人群中。统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(SAS，v. 9. I. 3)。统计学显著性水平P值设为O. 05，所有统计学检验均为双侧检验。以下是本发明进一步的说明在上述48例符合条件的胰腺癌病例及48例健康人对照中，两组年龄按个体精确匹配。我们将这两组人群作为探索性样本TLDA芯片检测获得相关结果。 根据TLDA芯片检测，本发明人检测到在“胰腺癌病例”组和“健康人对照”组的血清中存在差异表达(Λ Λ CT>2)的微小核糖核酸包括hsa-miR-451、hsa_miR-30e、hsa_miR-30a、hsa-miR-766、hsa_miR-30d、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-923、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-25、hsa-miR-122、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-16、hsa-miR-140_3p、hsa_miR-20b、hsa-miR-195、hsa-miR-93、hsa-miR-192、hsa-miR-532_5p、 hsa-miR-185、 hsa-miR-486_5p、 hsa_let_7b、 hsa_miR-193b、hsa_miR-20a、hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-186、hsa-miR-17、hsa_miR-92a、hsa_miR-19a、hsa-miR-660、hsa_miR-148a、hsa-miR-215、hsa_miR-18a、hsa_miR-106a、hsa_miR-19b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-223、hsa-miR-128、hsa-miR-130b、hsa-miR-106b、hsa-miR-483_5p、hsa-miR-339_3p、hsa-miR-101。我们选择在“胰腺癌病例”组和“健康人对照”组中CT值均小于35的miRNA，以提高检测效率，满足上述条件的 miRNAs 包括miR-451, miR-30e, miR-30a, miR-766, miR-30d和miR-409-3p。探针法和染料法qRT-PCR结果均发现在24例胰腺癌病例和24例健康人对照中，miR-451和miR-409-3p在“胰腺癌病例”组和“健康人对照”组中的表达情况存在
显著性差异。多因素Logistic回归分析结果表明，这2种miRNAs的表达水平均与胰腺癌的发病存在着显著关联miR-451在病例中高表达，miR-409-3p在对照中高表达。根据上述结果，将这2种与胰腺癌发病相关的miRNAs在24例胰腺癌病例和24例健康人对照中进一步的单个验证。我们发现血清/血浆高表达miR-451与胰腺癌发病相关联，低表达miR-409-3p与胰腺癌发病相关联，染料法的结果与探针法一致。进一步分析这2种miRNA的组合用于胰腺癌诊断的效果，发现其组合对胰腺癌发病诊断的 AUCtArea Under the ROC Curve, ROC 曲线(Receiver Operating CharacteristicCurve,受试者工作特征曲线)下面积与单个miRNA相比增加。根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于胰腺癌诊断的试剂盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟miR-451和miR-409-3p的引物和其他检测试剂。具体而言,这2种miRNAs,或者这2种miRNA的引物组合构成的相关诊断试剂盒有助于胰腺癌的诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持，从而最大限度提高胰腺癌患者的生存率。本发明的有益效果本发明提供的血清/血衆微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)标志物作为胰腺癌诊断的标志物的优越性在于(I)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物,不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于胰腺癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。 (2 )血清/血浆miRNAs试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒,可用于胰腺癌患者的辅助诊断，有助于反映胰腺癌患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病 情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人采用TLDA芯片检测以获取疾病特异和异常表达的血清/血浆miRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法进行单个验证，采用了两种不同的方法(荧光探针法和染料法)进行验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。本发明通过控制年龄和性别等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆miRNA在胰腺癌辅助诊断的应用前景，阐述异常表达的miRNAs对于胰腺癌进展的影响，揭示其筛查和诊断价值。因此，本发明获得了胰腺癌发病相关血清/血浆miRNAs表达数据库和特异性标志物；通过血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得胰腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
图I.显示胰腺癌病例组和健康人对照组miRNA的表达箱线图。图2.显示胰腺癌病例组对健康人对照组为参照的ROC曲线。其中..................合并miR-451和miR-409_3p :区分胰腺癌病例组与对照组=AUC
93. 8%，灵敏度95. 8%，特异度91. 7%。.........单独使用miR-451 :区分胰腺癌病例组与对照组AUC 91. 7%，灵敏度
91. 7%，特异度91. 7%_______单独使用miR-409_3p :区分胰腺癌病例组与对照组AUC 75. 0%，灵敏度
58. 3%，特异度91. 7%
具体实施例方式实施例I样品的收集和样品资料的整理病例为2007年6月-2010年12月在淮安市肿瘤医院及江苏省肿瘤医院收集的新发胰腺癌病例，均经病理组织学确诊。对照为同期进行社区疾病筛查的健康个体，按性别和年龄(±5岁)与病例进行频数匹配。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了 48例符合下列标准的样本作为TLDA芯片检测和后续一系列qRT_PCR验证的实验样品I、新发胰腺癌病例2、采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗3、与病例年龄、性别匹配的健康人对照并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。
实施例2血清/血浆中miRNA的TLDA芯片检测将24例胰腺癌患者和24例健康人对照经TLDA芯片检测获得相关结果。具体步骤为I、分别取“胰腺癌病例”组和“健康人对照”组患者的血清600 μ 1，加入3倍体积的Trizol试剂；2、相分离室温放置15min，加入终浓度为1(Γ4ρπιο1/μ I的cel-39 (TAKARA)作为内参，然后加入与血衆等体积的氯仿，震荡50s,室温15min,14, OOOrpm, 4°C,离心15min ；3,RNA沉淀将水相转移到新的15ml的离心管，加入I. 5倍水相体积的无水乙醇，充分混匀；4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA :每次吸取700 μ 样本至离心柱中，14，OOOrpm离心15s，弃去收集管中滤液，重复至样本均过柱；加入700 μ I洗液1，14, OOOrpm离心15s,弃收集管中滤液；加入500 μ I洗液2,14, OOOrpm离心15s,弃收集管中滤液；再加入500 μ I洗液2，14，OOOrpm离心2min，弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm离心2min以干燥离心管；将离心管放入新的I. 5ml管中，加入50 μ I无核酸酶水，10, OOOrpm离心Imin ;将管中的液体倒回离心柱中，14, OOOrpm离心Imin,弃离心柱；5、测量浓度通常能得到 1250ng RNA/600 μ I血清；6、用TLDA芯片配套的逆转录试剂盒通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括O. 8μ I逆转录引物(10Χ)、0. 2μ I IOOmM dNTPs混合物、I. 5 μ I逆转录酶(50U/μ L)、0. 8 μ I IOX逆转录缓冲液、O. 9 μ I 25mM氯化镁、O. I μ I RNA抑制剂以及O. 2 μ I无核酸酶水。加入3μ l(l-350ng)的总RNA。反应步骤为16°C孵育2分钟，42°C反应I分钟，50°C反应I秒，上述3步经40个循环反应，再85°C孵育5分钟；7、对芯片特异性的miRNA进行预扩增以增加表达所需的cDNA的量。预扩增的反应体系包括12. 5μ I预扩增Master Mix (2 X)、2· 5 μ I预扩增引物(10 X)、7· 5 μ I无核酸酶水、2. 5 μ I cDNA。反应步骤为95°C 10分钟一55°C 2分钟一72°C 2分钟一95°C 15秒、600C 4分钟，12个循环一99. 90C 10分钟；反应结束后加入75 μ I O. IX TE稀释；8、取9μ I稀释后的预扩增产物，加入450μ I基因表达Master Mix，441 μ I无核酸酶水，充分混匀后，在TLDA芯片上加入100 μ I/孔；IOOOrpm离心lmin，离心2次。TLDA芯片实验使用的是ABI Prism 7900突光定量PCR仪。选择384-well TaqMan Low DensityArray特定的程序进行反应；9、数据分析与处理用RQ-Manger软件进行数据处理，Ct阈值设为O. 2，Δ Ct=Ct#本-Ct39 (cel-39用以控制RNA提取、逆转录时的差异)，两组样品血清miRNAs的表达量比值可用方程Λ ACt表示，Λ Λ Ct= Λ Ctsw-Λ Ct WM。运用TLDA芯片检测发现的“胰腺癌病例”组和“健康人对照”组中血清差异表达的微小核糖核酸在上文中(见说明书第5-6页)已经罗列出。实施例3血清/血浆中miRNA的qRT-PCR实验根据上述TLDA结果,选择满足下列条件的miRNAs用qRT-PCR方法进一步的验证OTLDA芯片中两组研究对象的CT值均不大于35以提高检测效率；2)TLDA芯片中Λ Λ CT大于2。对所选择的miR-451、miR-409-3p两个miRNAs设计逆转录和qRT-PCR的引物(见表I)。对“胰腺癌病例”组和“健康人对照”组的血清单个个体进行miRNA的qRT-PCR检测。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。分别用染料法和探针法两种方法进行qRT-PCR检测。表I相关miRNA引物信息
miRNA引物(5，-3，)
上游引物 ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTAC
hsa- miR-451--
下游引物 Ci CAACl GGl G I.CGI GGAG i CGGCAA J i CAG l lGAGAAC I CAG i
上游引物 ACACTCCAGCTGGGGAATGTTGCTCGGTGA
hsa- miR-409-3p--
下游引物 CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGGTTC
^上游引物 ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTTGAC
hsa-miR-30e--
F 游引物 ΓΤΓΑΑΓΤΟΓιΤΟΤΓΟΤΟΟΑΟΤΓΟΟΓΛΑΤΤΓΑΓ ΤΤΟΑΟΓΤΤΓΓΑΟΤ
'上游引物 ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC
''下游弓 IVM CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT
^上游引牺 ACACTCCAGCTGGGAGGAGGAATTGGTGCT
hsa-miR-766 --
下-游引物 CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACCAG
上游引物 ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCCCGAC
hsa-miR-30d--
T 游引物 CTCAArrGGTGTCGTGGAGTCGGCAA 丁 TCAGTTGAGCTTCCAGT(I)制备RNA样品a)取100 μ I血清；b)加3倍体积的Trizol室温放置15min，加入终浓度为10-4pmol/μ I的cel-39 (TAKARA)作为内参，然后加入与血浆等体积的氯仿，震荡50s,室温15min, 14, OOOrpm, 4°C,离心15min ;c)将水相转移到新的15ml的离心管，加入I. 5倍水相体积的无水乙醇，充分混匀；d)用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA :每次吸取700 μ I样本至离心柱中，14，OOOrpm离心15s，弃去收集管中滤液，重复至样本均过柱；加入700 μ I洗液1，14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500 μ I洗液2，14，OOOrpm离心15s,弃收集管中滤液；再加入500 μ I洗液2,14，OOOrpm离心2min,弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm离心2min以干燥离心管；将离心管放入新的I. 5ml管中，加入50 μ I无核酸酶水，10，OOOrpm离心Imin ;将管中的液体倒回离心柱中，14，OOOrpm离心lmin，弃离心柱，将管中的液体作为RNA样品；(2)探针法使用ABI试剂盒。a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录反应体系包括0. 15 μ I IOOmMdNTPs混合物、I μ I逆转录酶(50U/ μ L)、I. 5 μ I 10Χ逆转录缓冲液、0. 19 μ I RNA抑制剂以及3μ I 5Χ逆转录引物一种或几种的混合物(指引物总量3μ 1，如一种引物的量为3μ 1，二种引物则分别为I. 5 μ 1，三种引物则分别为I. O μ 1，即多种引物时，每种引物的量为总量的平均值，下同)。加入9. 16 μ I的总RNA。反应步骤为16°C孵育30分钟，42°C反应30分钟，85 °C孵育5分钟；b) q-PCR 将cDNA加入5 μ I水稀释，取I μ I稀释后的cDNA，加入O. 25 μ I20 X MicroRNA检测探针、2· 5μ I 2 X基因表达Master Mix、I. 25 μ I双蒸水，5 μ I体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是95°C、5分钟进行I个循环一950C、15秒，60°C、I分钟进行45个循环。(3)染料法a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包括4 μ I 5 X AMV缓冲液、2 μ I IOmM dNTP 混合物(Takara 公司)、0· 5μ I RNase 抑制剂(Takara 公司)、2μ IAMV (Takara公司)以及I. 5μ I miRNA特异性反向引物一种或几种的混合物。反应步骤为16°C孵育15分钟，42°C反应I小时，85°C孵育5分钟； b) q-PCR :将 cDNA 按 1/5 体积稀释，取 O. 5μ I 稀释后的 cDNA，加入 O. 15μ I Taq酶(Takara 公司)，0· 5μ I 20 X EVA GREEN, O. I μ I 10 μ M 正向引物一种，0· I μ I IOyMffl用反向引物(URP:TGGTGTCGTGGAGTCG，SEQ ID No. 15),0. 6μ I 25mM MgCl2,0. 8 μ I 2. 5mMdNTP混合物(Takara公司)，I μ I 10XPCR缓冲液，6. 75 μ I双蒸水，10 μ I体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是95°C、5分钟进行I个循环一950C、15秒，60°C、I分钟进行45个循环。(4)数据处理与分析两组样品血清miRNAs的表达量比值可用方程f 表示，其中Λ Ct=CTtMi-CT @#，我们在每一个样本提取时加入cel-39的RNA作为参照，计算相对表达量(cel-39:SEQ IDNo. 13 和 SEQ ID No. 14)。探针法和染料法qRT-PCR结果均发现在48例样本中，有2种miRNAs (miR-451和miR-409-3p)在两组间的表达情况存在显著性差异，探针法结果见表2、表3、图I、图2、染料法结果与探针法类似，不再列出。表2单因素logistic回归分析结果
权利要求
1.一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物，其特征在于该标志物为miR-451和miR-409-3p 的组合。
2.权利要求I所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，其特征在于该引物为 miR-451 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ;miR-409_3p 的引物为 SEQ ID No. 3 和SEQ ID No. 4。
3.权利要求I所述的血清/血浆miRNA标志物在制备胰腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的血清/血浆miRNA标志物的引物在制备胰腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.一种胰腺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测血清/血浆中miR-451和 miR-409-3p。
6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒,其特征在于该试剂盒含有血清/血楽;miRNA中miR-451 和 miR-409_3p 的引物。
7.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的血清/血浆miRNA标志物的引物。
8.根据权利要求6或7所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂。
全文摘要
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，公开了一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。该标志物为miR-451和miR-409-3p的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于胰腺癌的辅助诊断。
文档编号C12N15/113GK102876676SQ20121035970
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者潘峰, 高勇, 祁付珍, 胡志斌, 董静, 闻洋 申请人:南京医科大学