专利名称：泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因领域，具体是一种泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒。
背景技术：
性传播疾病是一类严重危害人类健康的疾病。我国近20多年来，性传播疾病病例逐年增高，其中以支原体感染率的增高尤为显著。支原体是一类大小介于细菌与病毒的能在体外培养基中生长繁殖的最小的微生物，广泛存在于动物、植物和人类。已确定的对人类有致病性的支原体主要有7种,它们是肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mpn)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)、人型支原体(Mycoplasma hominis, Mh)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium, Mg)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans, Mf)、穿通支原体 (Mycoplasma penetrans, Mpe )和梨支原体(Mycoplasma pi rum, Mpi ),均可通过性传播而导致男女泌尿生殖系统感染。支原体感染后可导致各种妇科炎症及非淋菌性尿道(阴道)炎(Nongonococcalurethritis，NGU)、附件炎、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎及各种不良妊娠结局(自然流产、胎膜早破、早产、低体重新生儿)和男性不育、附睾炎、前列腺炎等，还可通过胎盘感染胎儿，使新生儿受累，发生新生儿肺炎、脑膜炎、败血症等。此外发现Mpe、Mf、Mpi能增强HIV的复制，促进HIV的细胞毒作用，导致HIV感染进一步发展，也可引起全身感染、多器官功能衰竭及急性呼吸窘迫呼吸症，因此被认为是AIDS相关支原体。解脲支原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)分为两个生物群和14种血清型，即U. parvum (以前的 Biovarl/parvum 群，包括血清型 1、3、6、14)和 U. urealyticum (以前的Biovar2/T960群，包括血清型2、4、5、7 13)。有研究指出由于不同血清型的Uu毒力不同，其致病性亦不同，U. urealyticum或U. parvum多种血清型的混合感染更容易致病。临床上检出不同生物群Uu的治疗与否、不同生物群Uu菌株体外抗菌药物敏感性及临床治疗过程中抗菌药物的合理选择等一系列方面都可能存在差异，故有必要在临床检验中对Uu进行生物分型。目前支原体检测方法有形态学检查法、培养法、免疫学方法和分子生物学方法。培养法是检测支原体的金标准，但是培养的要求较高且培养的周期较长，并且由于培养基易被杂菌污染，故在临床普及较困难。生殖支原体的临床分离培养更困难。免疫技术要有特异的抗血清，而且易出现交叉反应。PCR技术本身的优越性是无可厚非的，但是使用不当很容易引起交叉污染，出现假阳性；如果反应条件控制不好也可能出现假阴性。以上的检测方法除了自身固有的缺陷外，最大的问题就是只能检测一种特定的支原体，而引起泌尿生殖道感染的支原体多为混合感染。各种支原体的耐药性不一样，为临床治疗带来困难。因此研制和开发一种特异性强、敏感性高同时又快速、经济，能同时检验多种支原体的支原体分型检测方法显得尤为重要，对性传播疾病和艾滋病的诊断和治疗起着重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能简单、快速和准确检测7种致病支原体解脲支原体(Uu)、人型支原体(Mh)、生殖支原体(Mg)、肺炎支原体(Mpn)、穿通支原体(Mpe)、梨支原体(Mpi )、发酵支原体(Mf )，并能对解脲支原体进行血清分型的泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒。本发明的一种泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒，包括
(1)一个基因芯片，其上带有
(i )不同种的支原体的核苷酸探针，其中探针至少是一个选自SEQ ID N0S:1-11和与SEQ ID Nos: 1-11互补的序列，探针序列如下
名称序列序列号
Mpe-P 5' -atagctcaaacttcaaccgtgt-31(SEQ ID No. I)
Mpi-P 5' -ggactgcaatgcgaacact-3!(SEQ ID No. 2)
Mpn-P 5' -actcagctaatatctggcatctc-3!(SEQ ID No. 3)
Mf-P 5f -attagactatgaatacatgaacg-3!(SEQ ID No. 4)
Mh-P 5! -acctgcatcatcgcatgcaa-3!(SEQ ID No. 5)
Mg-P 5' -gacgcattcgctcgctaca-3!(SEQ ID No. 6)
Uuu-P 5! -gtaatatctaaacatagatataacaact-3! (SEQ ID No. 7)
Uupl-P 5! -actatcataattaatatagataataaact-3! (SEQ ID No. 8)
Uup3-P 5r -gttaatagattagcttatcttactgaat-3! (SEQ ID No. 9)
Uup6_P 5! - tattgtaactattatttaatataataaatc-3! (SEQ ID No. 10)
Uupl4-P 5' -gtgatataatagttaagtaaaatatt-3!(SEQ ID No. 11)
(ii)标记有生物素点的DNA序列(Bio)，用于监控杂交是否成功，序列为SEQIDNo. 12
Bio 5! -cgtccaaggggaaactgatct-3! (SEQ ID No. 12);
(iii)带有编码β-actin蛋白部分的DNA序列(1C)，作为内控点，用于监控PCR体系是否成功，序列为SEQ ID No. 13
IC5' -cacgagattcacaatgctca-3!(SEQ ID No. 13);
(2)各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，选自SEQID Nos:14-22,其序列分别如下
(i)用于扩增Uuu、UupUUup3、Uup6、Uupl4的引物，针对支原体DNA的multiplebanded antigen gene 设计，其序列为 SEQ ID Nos: 14 -17
MBA-F 5' -gatatgcattctttatatattgtct-3! (SEQ ID No. 14)
MBA-R 5, -atttgttrttttcarctgagttac-3! (SEQ ID No. 15)
Uuu-R 5' -actaactgctcccactcc-3!(SEQ ID No. 16)
Uup-R 5! -gcactccaaccgaagtaccaat-3! (SEQ ID No. 17)
(ii)用于扩增Mh的引物，针对支原体DNA的16SrRNA基因设计，其序列为SEQ IDNos:18-20
Myco-F 5' -gtacctgkgatgaacctg-3!(SEQ ID No. 18)
Mh_F2 5' -cctgtgcaatgagagatccga-3! (SEQ ID No. 19)Mh-R2 5' -agttgtaccactgcactgc-3'(SEQ ID No. 20)
(iii)用于扩增Mg、Mpn、Mpe、Mpi的引物，针对支原体DNA的16SrRNA基因设计，其序列为 SEQ ID No. 18 和 SEQ ID No. 21
Myco-F 51 -gtacctgkgatgaacctg-31(SEQ ID No. 18)
MGP-680R 51 -tgtatgtctatytaacycagac-31 (SEQ ID No. 21)
(iv)用于扩增Mf的引物，针对支原体DNA的16SrRNA基因设计，其序列为SEQ IDNo.18 和 SEQ ID No. 22
Myco-F 51 -gtacctgkgatgaacctg-31(SEQ ID No. 18)Mf- 700R 51 -gaagtccttcctgaaggttg-31 (SEQ ID No. 22)
其中r表示a或g, k表示g或t, y表示c或t。本发明针对每一种支原体设计的探针有着合理的碱基成分，探针的Tm值在42°C到48°C之间，相对比较均一，即11种探针和对应的PCR产物杂交时最适宜的温度条件基本一致，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。本发明上述的试剂盒，所述引物SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20和SEQ ID No. 21的5'端标记有生物素。本发明所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤
(1)DNA探针的制备合成与支原体DNA互补的5'末端经过胺基化的DNA片段
(2)固定探针将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上
先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的胺基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固地将探针固定在膜上；
(3)制备基因芯片利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。利用本发明所述的支原体分型检测试剂盒检测支原体感染的方法包括以下步骤利用支原体分型检测试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA，对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片表面上结合的DNA。具体步骤如下
第一步扩增样品
将临床样本中提取的DNA通过支原体分型检测试剂盒进行扩增，所用的部分引物5'端标记有生物素，扩增得到的5'端带有生物素标记的DNA产物；
第二步:杂交
使用导流杂交技术，将上述扩增得到的DNA与基因芯片上面分布的DNA探针、Bio和IC进行反应；
第三步显色
在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIP系统显色，肉眼直接观察结果。在基因检测中，由于操作步骤繁琐，操作失误难以避免，本发明在试剂盒中使用了标记有生物素点的DNA序列和带有编码β -actin蛋白部分的DNA序列，分别用于监控杂交和PCR体系是否成功，便于操作人员在检测过程出错时，快速区分是在PCR时出错还是在杂交时出错，以便迅速找出发生错误的原因，缩短检测时间。另外，在现有技术中，由于探针载体多采用玻璃等，通透性差，一般只能使用传统杂交方法进行杂交，操作起来较为麻烦，检测时间长，一般至少都在6个小时以上，而且显色结果的背景不干净；本发明使用尼龙膜做为探针载体，由于尼龙膜较其它固体支持物(如玻璃等)具有良好的通透性，不但利于导流杂交技术的应用，且具有很好的弹性，便于生产和操作，缩短了检测时间，只需要I. 5小时左右，显色结果的背景干净。本发明所述泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒能快速、准确地检测出泌尿生殖道致病支原体感染及感染的类型，对于泌尿生殖道疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。图I是表示基因芯片上探针和监控点的类型和具体的分布位置的图片，“Bio”代表标记有生物素点的DNA序列；“IC”代表带有编码β -actin蛋白部分的DNA序列；Uuu表 示解脲支原体的 T960 群(包括血清型 2,4, 5，7,8,9, 10，11，12，13)；Uupl,Uup3,Uup6,Uupl4分别表示解脲支原体的血清型I，3，6和14 ;Mh表示人型支原体；Mg表示生殖支原体；Mf表示发酵支原体;Mpe表示穿通支原体;Mpn表示肺炎支原体;Mpi表示梨支原体,“ + ”代表位置标记。图2是表示阴性的结果的图片。图3a是表示解脲支原体(Uu) Uuu感染的图片。图3b是表示解脲支原体(Uu) Uupl感染的图片。图3c是表示解脲支原体(Uu) Uup3感染的图片。图3d是表示解脲支原体(Uu) Uup6感染的图片。图3e是表示解脲支原体(Uu) Uup 14感染的图片。图4a是表示人型支原体(Mh)感染的图片。图4b是表示生殖支原体(Mg)感染的图片。图4c是表示发酵支原体(Mf)感染的图片。图4d是表示穿通支原体(Mpe)感染的图片。图4e是表示肺炎支原体(Mpn)感染的图片。图4f是表示梨支原体(Mpi)感染的图片。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进行详细的说明。实施例中，20%的EDAC溶液、O. 1%SDS、0. 25%脱脂奶粉、O. 05%硫柳汞、O. 05%叠氮钠均是指质量比，O. l%Tween20是指体积比。步骤I基因芯片的制备
根据人体泌尿生殖道感染致病支原体的情况，选择了 7种致病支原体解脲支原体(Uu)、人型支原体(Mh)、生殖支原体(Mg)、肺炎支原体(Mpn)、穿通支原体(Mpe)、梨支原体(Mpi)、发酵支原体(Mf)，并对解脲支原体进行了血清分型检测。针对每一种支原体，设计与合成5'端带有胺基的特异性基因探针，并制备IC和Bio，用于泌尿生殖道支原体的检测。
DNA基因芯片的制作步骤如下将制备的探针、IC和Bio首先溶解在超纯水中，制成浓度为200M的母液，然后溶解在PH=8. 4的O. 5M Na2CO3和O. 5M NaHCO3的溶液中，使其最终浓度为2M。对尼龙膜进行处理，首先放入O. IM HCL溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放进20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200mL的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20°C、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，装入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4°C的温度下，备用。通过微量移液设备将上述制备好的探针、IC和Bio分别点在上述处理过的尼龙膜上，每滴0.4L。点膜完成后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入O. IM NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20°C、湿度为45%的烘干箱内放置12小时，即制得基因芯片。
步骤2样品制备 步骤2-1阳性对照组样品的制备
利用引物Myco-F，Mh-F2和Mh_R2对插入到pMD_T vector中的Mh DNA片段进行扩增。PCR 反应体系为 50L，包含 10Xbuffer，5. OL ;25mM MgC12,6. OL ；25mM dNTP，I. OL ;IOM 生物素标记引物 MBA-F，O. 5L ; IOM 引物 MBA-R, O. 5L ;IOM 引物 Uuu-R, O. 5L ; IOM 引物 Uup-R,O. 5L ;IOM生物素标记引物Myco-F，I. OL ;IOM引物Mh_F2，O. 5L ;10M生物素标记引物Mh_R2，O. 5L ； IOM 生物素标记引物 MGP-680R, O. 5L ; IOM 引物 Mf-700R, O. 5L ;内对照 DNA1. OL ；ddH20, 29. 5L ；5U/ L TaqDNA 聚合酶，O. 5L ;模板 DNA, 2. OL ;共 50L。PCR 反应程序为首先95°C变性9分钟，然后95 °C，20秒；55°C，30秒；72°C，50秒；进行40个循环，最后72°C延伸5分钟。步骤2-2支原体标准品的制备
同步骤2-1相似步骤制备生物素结合的扩增支原体DNA样品，不同之处在于利用上述各种质粒作为模板。步骤2-3临床样本中DNA样品的制备
利用煮沸和异丙醇沉淀法制备和纯化临床样本中的DNA，然后参照步骤2-1中的方法扩增得到带有生物素标记的DNA。步骤3利用DNA基因芯片检测支原体DNA
利用导流杂交技术，将步骤2中扩增得到的DNA样品用步骤I中制备的基因芯片进行检测，DNA样品和基因芯片中尼龙膜上的探针、Bio和IC反应，最后根据显色情况进行判断，有显色的探针点表示相应的支原体类型，IC点显色表示扩增成功，Bio点显色表示杂交成功。进行临床样本检测的同时，做支原体Mh阳性对照和阴性对照。将扩增获得的50L产物95°C下变性5 10分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置3分钟。然后加入到事先温浴到45°C的0.8mL杂交液中(2XSSC/0. 1%SDS)，混匀后加入到杂交仪的反应孔中，应用于步骤I制得的基因芯片，45°C杂交20分钟。然后用WBl(I X SSC/0. 1%SDS)，45°C温浴，清洗3遍。加入O. 5mL封阻液(O. 25%脱脂奶粉，O. 05%硫柳汞)，25°C封闭5分钟。抽干后加入O. 5mL的酶标液(TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶)，酶标5分钟。用O. 8mL溶液A (TBS, O. l%Tween 20及O. 05%叠氮钠)清洗4遍，然后加入O. 5mL的显色液(NBT/BCIP)，避光显色5 分钟。最后用杂交液(2XSSC/0. 1%SDS)冲洗3遍,晾干,分析显色情况,判读结果。
权利要求
1.一种泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒，包括 (1)一个基因芯片，其上带有 (i )不同种的支原体的核苷酸探针，其中探针至少是一个选自SEQ ID Nos: 1-11和与SEQ ID Nos:l-ll互补的序列； ( )标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ ID No. 12; (iii)带有编码β -actin蛋白部分的DNA序列，作为内控点，序列为SEQ ID No. 13; (2)各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，选自SEQID Nos:14-22,其序列分别如下 (O用于扩增Uuu、UupU Uup3、Uup6、Uupl4的引物,针对支原体DNA的multiplebanded antigen gene 设计，其序列为 SEQ ID Nos: 14 -17 ； (ii)用于扩增Mh的引物，针对支原体DNA的16SrRNA基因设计，其序列为SEQ IDNos:18-20 ； (iii)用于扩增Mg、Mpn,Mpe, Mpi的引物，针对支原体DNA的16S rRNA基因设计，其序列为 SEQ ID No. 18 和 SEQ ID No. 21 ； (iv)用于扩增Mf的引物，针对支原体DNA的16SrRNA基因设计，其序列为SEQ IDNo.18 和 SEQ ID No. 22 ； 其中r表示a或g, k表示g或t, y表示c或t。
2.权利要求I所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
3.权利要求I所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
4.权利要求I所述试剂盒，其特征在于，所述引物SEQID No. 14、SEQ ID No. 18、SEQID No. 20和SEQ ID No. 21的5'端标记有生物素。
全文摘要
本发明公开了一种泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒，包括(1)一个基因芯片，其上带有(ⅰ)不同种的支原体的核苷酸探针，其中探针至少是一个选自SEQIDNos:1-11和与SEQIDNos:1-11互补的序列；(ⅱ)标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQIDNo.12;(ⅲ)带有编码β-actin蛋白部分的DNA序列，作为内控点，序列为SEQIDNo.13;(2)各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，选自SEQIDNos:14-22。本发明试剂盒能快速、准确地检测出泌尿生殖道致病支原体感染及感染的类型，对于泌尿生殖道疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK102864231SQ20121036324
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者陈伟坚, 梁秋菊, 谢龙旭 申请人:广东凯普生物科技股份有限公司