专利名称：一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种无乳链球菌的检测方法，特别是一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法。
背景技术：
罗非鱼是全球主要经济鱼类之一，具有生长快、抗病力与抗逆性强、肉质好、繁殖力强、适应性广以及群体产量高等一系列优点，现已成为南方各省出口型养殖规模最大的鱼类，产量占全世界的50%，罗非鱼产业对于增加就业机会、提高农民收入都有十分重要的意义。然而近年来，由于高密度饲养，种群退化，加上养殖水质、环境及气候恶化，各类病害时常大面积爆发，严重影响到罗非鱼产业的健康发展。2009 2011年，国内主要的罗非鱼养殖区爆发了非常严重的罗非鱼流行病，患病罗非鱼在水面离群独游，游姿失衡，眼球突出，被养殖户形象的称为“突眼病”。该病发病率一般达20% 30%，死亡率在95%以上。 病原分析表明引起罗非鱼“突眼病”的病原为链球菌，主要为海豚链球菌印tococcusiniae)和无乳链球菌{Streptococcus agalactiae)。据统计，近几年因链球菌病导致罗非鱼产业的损失达20亿元，如何防治罗非鱼链球菌病已成为农业和渔业管理部门最为关注的问题。分子诊断技术是当代医学发展的重要前沿领域之一，主要包括免疫诊断技术和分子生物学诊断技术，二者都具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高的特点。免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，检测病原微生物，简化了病原微生物的鉴定步骤，备受关注。各大文献数据库提供的数据显示，几乎建立了所有病原体的血清学检测方法，表明该方法已成为一种微生物实验室常用的成熟的检测技术，具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高等特点。免疫学方法中常见的几种诊断技术包括凝集技术、荧光抗体技术、酶联免疫技术等。随着分子生物学技术的迅速发展，使人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征，微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平检测，对于那些难培养和不可能培养的微生物，可直接通过获得基因信息，给微生物学的检测带来崭新的领域。分子生物学诊断技术中常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、多位点序列分型、环介导等温扩增技术等。同免疫诊断试剂相比较，分子生物学诊断试剂具有生产工艺简单，灵敏度更高的特点，逐渐成为新一代分子诊断试剂开发的主流。CAMP因子是无乳链球菌特异性产生的一种蛋白质，是无乳链球菌区别于其他细菌的重要特征指标。在传统的无乳链球菌生理生化鉴定中，CAMP试验已成为鉴定无乳链球菌的关键试验。CAMP因子的编码基因是￠/ 基因，利用分子生物学技术检测样品中是否含有c/办基因即可判断样品是否受到了无乳链球菌的感染。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification,简称 LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件￠3 °C左右)保温3(T60 min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，能不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测。罗非鱼链球菌病是危害罗非鱼养殖业最严重的爆发性疾病，无乳链球菌是最主要的病原菌。通过分子检测手段，在养殖过程中定期检测罗非鱼是否受到无乳链球菌的感染，是预防链球菌病的一种有效措施。目前已公开的专利和论文多使用PCR的方法检测无乳链球菌，该方法能够特异性的检测无乳链球菌，但检出灵敏度低，只适用于感染后期鱼体内病原菌含量较多的时候。由于感染已发展至后期，因此在得出检测结果后采取预防措施的效果会大打折扣，更有可能在采取措施之前，疾病就已爆发。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种测试灵敏度高、测试速度快的罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法。·
解决上述技术问题的技术方案是一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，包括以下步骤
51.抽取待检罗非鱼的血液广2mL，提取血液中的总RNA;
52.以所提取的总RNA为模板，进行反转录反应，获得待测罗非鱼血液样品的cDNA；
53.根据无乳链球菌的￠/ 基因序列设计并合成用于环介导等温扩增的引物；
54.以上述步骤S2中获得的cDNA为模板，利用上述步骤S3中合成的引物，进行目标基因的环介导等温扩增；
55.扩增完成后，检测反应结果，结果阳性的表示供检罗非鱼感染了无乳链球菌，结果阴性的表示供检罗非鱼没有感染无乳链球菌。本发明的进一步技术方案是步骤SI中所述的提取罗非鱼血液总RNA，具体方法如下
511.抽取待检罗非鱼的血液ImL，将其于转速为5000 rpm离心10 min，去掉上清液后加入I mL用于总RNA抽提的trizol试剂，反复吹打重悬沉淀，得重悬液；
512.将上述步骤Sll中所得的重悬液于室温静置5min后，每ImL trizol加O. 2 mL氯仿，用手轻摇3-5次，使得氯仿和trizol试剂混合均匀，在室温静置2-3min后，于4_8°C，转速12000 rpm离心15 min,离心后,溶液分为水层、中间层和氯仿层共3层；
513.将上述步骤S12中的水层O.4-0. 5 mL转移到一只干净的I. 5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，用手轻摇3-5次混匀，在室温放置10 min,于4_8°C，转速12000 rpm离心10 min,离心后弃去上清液,所得沉淀备用；
514.将上述步骤S13中所获的沉淀，用ImL浓度为75%乙醇洗涤后，在4-8°C，转速7500rpm离心5 min,离心后弃去上清液,所得沉淀即为提取的总RNA ；
515.将上述步骤S14获得的RNA自然干燥后加入40μ L去RNA酶水进行溶解。步骤S2中所述的以所提取的总RNA为模板，进行反转录反应，具体方法如下
S21.配制反应体系20 μ L，包括RNA模板I μ 1，5倍反应缓冲液4 μ L，浓度为10 mmol/L
的dNTP 2 μ L，浓度为IOU/ μ L的RNA酶抑制剂2 μ L，浓度为25 μ mo I/L的随机弓丨物I μ L，浓度为5U/ μ L的反转录酶2 μ L，添加去RNA酶水至总体积20 μ L ;上述的 5 倍反应缓冲液由 ρΗ=8· 3 的 Tris-HCl 250 mmol/L,KCl 375 mmol/L,MgCl2 40mmol/L 和 DTT 50 mmol/L 组成而得；
522.轻微混匀通过上述步骤S21所得的反应液，于室温放置10min后移入42°C恒温槽中保温I h ；
523.将经过上述步骤S22的反应液于冰水中冷却2min完成反转录反应，获得待测罗非鱼血液样品的cDNA。步骤S3中所述的引物是根据GenBank数据库提供的无乳链球菌的￠/ 基因序列，并结合环介导等温扩增技术的原理设计并合成，分别是
PI: 5-ATGAACGTTACACATATGATGT-3 ； P2: 5-GTTCCCTGAACATTATCTTTGA-3 ；
P3: 5-TCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGATCTATCTGGAACTCTAGTGG-3 ；
P4: 5-AGTGACAACTCCACAAGTGGTAGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAG-3。步骤S4中所述的目标基因的环介导等温扩增的具体方法如下
541.配制反应体系25μ L，包括10倍反应缓冲液2. 5 μ L，浓度为25mmol/L的MgSO44 μ L、浓度为IOmmoI/L的dNTP 4 μ L，浓度为20ymol/L的引物Pl和P2各I. 5 μ L，浓度为10 μ mo I/L的引物P3和P4各O. 5 μ L，浓度为8U/ μ L的Bst DNA聚合酶大片段I μ L，步骤S2中获得的cDNA模板2 μ L，添加ddH20至总体积25 μ L ；
上述上 10 倍反应缓冲液由 ρΗ=8· 8 的 Tris-HCl 200mmol/L, KCl 100 mmol/L, (NH4)2SO4100 mmol/L, MgSO4 20 mmol /L 和 TritonX-100 1%组成而得;
542.轻微混匀通过上述步骤S41所得的反应液，于65°C保温Ih ；
543.将经过上述步骤S42的反应液于80°C保温IOmin以终止反应。步骤S5中所述的扩增完成后，检测反应结果的方式为直接用肉眼观察反应结果，若步骤S4中的反应体系中出现白色沉淀者为阳性，说明血液样品中含有无乳链球菌，即表示带检罗非鱼已受到无乳链球菌的感染。步骤S5中所述的扩增完成后，检测反应结果的方式为使用DNA染料SYBR GreenI染料进行染色，即向步骤S4中的反应液中加入SYBR Green I I μ L，若反应体系在紫外灯下出现绿色荧光为阳性，说明血液样品中含有无乳链球菌，即表示带检罗非鱼已受到无乳链球菌的感染。该方法不经过细菌的培养，直接以罗非鱼血液为样本进行检测。由于采用上述技术方案，本发明之一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法有以下有益效果
I.检测灵敏度高
本发明结合了反转录技术和环介导等温扩增技术，通过反转录的方法将菌体内单拷贝的Cfb基因转变为多拷贝，再通过环介导等温扩增技术对目标基因进行检测，从而大大提高了检测灵敏度高。检出限可到达l(Tl00CFU/mL，能够在罗非鱼感染无乳链球菌初期检出体内的无乳链球菌，为罗非鱼链球菌病的预防提供新的技术手段。2.检测速度快
本发明通过分子生物学方法检测罗非鱼血液中是否存在无乳链球菌基因，从而判断被检罗非鱼是否受到了无乳链球菌感染。检测结果可用肉眼直接观察，整个检测时间小于5h。本方法使用罗非鱼的血液为样品进行检测，可以对罗非鱼进行抽血，不会致死，同时也减少了使用肝、脾等器官进行检测时所必需的组织碾磨的步骤。3.特异性高
本发明之一种罗非鱼无乳链球菌高灵敏度的快速检测方法，以无乳链球菌特有的Cfb基因为目标基因，能避免其他细菌的干扰而特异性的检测无乳链球菌。
具体实施例方式 一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，包括以下步骤
SI.抽取待检罗非鱼的血液广2 mL，提取血液中的总RNA ;具体方法如下
511.抽取待检罗非鱼的血液ImL，将其于转速为5000 rpm离心10 min，去掉上清液后 加入I mL用于总RNA抽提的trizol试剂，反复吹打重悬沉淀，得重悬液；
512.将上述步骤Sll中所得的重悬液于室温静置5min后，每ImL trizol加O. 2 mL氯仿，用手轻摇3-5次，使得氯仿和trizol试剂混合均匀，在室温静置2-3min后，于4_8°C，转速12000 rpm离心15 min,离心后,溶液分为水层、中间层和氯仿层共3层；
513.将上述步骤S12中的水层O.4-0. 5 mL转移到一只干净的I. 5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，用手轻摇3-5次混匀，在室温放置10 min,于4_8°C，转速12000 rpm离心10 min,离心后弃去上清液,所得沉淀备用；
514.将上述步骤S13中所获的沉淀，用ImL浓度为75%乙醇洗涤后，在4-8°C，转速7500rpm离心5 min,离心后弃去上清液,所得沉淀即为提取的总RNA ；
515.将上述步骤S14获得的RNA自然干燥后加入40μ L去RNA酶水进行溶解。S2.以所提取的总RNA为模板，进行反转录反应，获得待测罗非鱼血液样品的cDNA ;具体方法如下
521.配制反应体系20μ L，包括RNA模板I μ 1，5倍反应缓冲液4 μ L，浓度为10 mmol/L的dNTP 2 μ L，浓度为IOU/ μ L的RNA酶抑制剂2 μ L，浓度为25 μ mo I/L的随机引物I μ L，浓度为5U/ μ L的反转录酶2 μ L，添加去RNA酶水至总体积20 μ L ;
上述的 5 倍反应缓冲液为由 ρΗ8. 3 的 Tris-HCl 250 mmol/L, KCl 375 mmol/L, MgCl240 mmol/L 和 DTT 50 mmol/L 组成而得；
522.轻微混匀通过上述步骤S21所得的反应液，于室温放置10min后移入42°C恒温槽中保温I h ；
523.将经过上述步骤S22的反应液于冰水中冷却2min完成反转录反应，获得待测罗非鱼血液样品的cDNA。S3.根据无乳链球菌的Cfb基因序列设计并合成用于环介导等温扩增的引物； 其中，所述的引物是根据GenBank数据库提供的无乳链球菌的cfb基因序列，该序列在
数据库中的登陆号为NC_007432，并结合环介导等温扩增技术的原理设计并合成，分别是 PI: 5-ATGAACGTTACACATATGATGT-3 ；
P2: 5-GTTCCCTGAACATTATCTTTGA-3 ；
P3: 5-TCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGATCTATCTGGAACTCTAGTGG-3 ；
P4: 5-AGTGACAACTCCACAAGTGGTAGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAG-3。S4.以上述步骤S2中获得的cDNA为模板，利用上述步骤S3中合成的引物，进行目标基因的环介导等温扩增；具体方法如下541.配制反应体系25μ L，包括10倍反应缓冲液2. 5 μ L，浓度为25mmol/L的MgSO44 μ L、浓度为IOmmoI/L的dNTP 4 μ L，浓度为20ymol/L的引物Pl和P2各I. 5 μ L，浓度为10 μ mo I/L的引物P3和P4各O. 5 μ L，浓度为8U/ μ L的Bst DNA聚合酶大片段I μ L，步骤S2中获得的cDNA模板2 μ L，添加ddH20 (重蒸水)至总体积25 μ L ;
上述上 10 倍反应缓冲液为由 ρΗ8. 8 的 Tris-HCl 200mmol/L, KCl 100 mmol/L,(NH4)2SO4 100 mmol/L, MgSO4 20 mmol/L 和 TritonX-100 1%组成而得;
542.轻微混匀通过上述步骤S41所得的反应液，于65°C保温Ih ；
543.将经过上述步骤S42的反应液于80°C保温IOmin以终止反应。S5.扩增完成后，检测反应结果，结果阳性的表示供检罗非鱼感染了无乳链球菌，结果阴性的表示供检罗非鱼没有感染无乳链球菌；其中，检测反应结果的方式为直接用肉眼观察反应结果，若步骤S4中的反应体系中出现白色沉淀者为阳性，说明血液样品中 含有无乳链球菌，即表示带检罗非鱼已受到无乳链球菌的感染；也可以使用DNA染料SYBRGreen I进行染色，即向步骤S4中的反应液中加入SYBR Green I I μ L，若反应体系在紫外灯下出现绿色荧光为阳性，说明血液样品中含有无乳链球菌，即表示带检罗非鱼已受到无乳链球菌的感染。本发明之一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法不经过细菌的培养，直接以罗非鱼血液为样本进行检测。
权利要求
1.一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，其特征在于包括以下步骤 51.抽取待检罗非鱼的血液广2mL，提取血液中的总RNA; 52.以所提取的总RNA为模板，进行反转录反应，获得待测罗非鱼血液样品的cDNA； 53.根据无乳链球菌的￠/ 基因序列设计并合成用于环介导等温扩增的引物； 54.以上述步骤S2中获得的cDNA为模板，利用上述步骤S3中合成的引物，进行目标基因的环介导等温扩增； 55.扩增完成后，检测反应结果，结果阳性的表示供检罗非鱼感染了无乳链球菌，结果阴性的表示供检罗非鱼没有感染无乳链球菌。
2.根据权利要求I所述的一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，其特征在于步骤SI中所述的提取罗非鱼血液总RNA，具体方法如下 511.抽取待检罗非鱼的血液ImL，将其于转速为5000 rpm离心10 min，去掉上清液后加入I mL用于总RNA抽提的trizol试剂，反复吹打重悬沉淀，得重悬液； 512.将上述步骤Sll中所得的重悬液于室温静置5min后，每ImL trizol加O. 2 mL氯仿，用手轻摇3-5次，使得氯仿和trizol试剂混合均匀，在室温静置2-3min后，于4_8°C，转速12000 rpm离心15 min,离心后,溶液分为水层、中间层和氯仿层共3层； 513.将上述步骤S12中的水层O.4-0. 5 mL转移到一只干净的I. 5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，用手轻摇3-5次混匀，在室温放置10 min,于4_8°C，转速12000 rpm离心10 min,离心后弃去上清液,所得沉淀备用； 514.将上述步骤S13中所获的沉淀，用ImL浓度为75%乙醇洗涤后，在4-8°C，转速7500rpm离心5 min,离心后弃去上清液,所得沉淀即为提取的总RNA ； 515.将上述步骤S14获得的RNA自然干燥后加入40μ L去RNA酶水进行溶解。
3.根据权利要求I所述的一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，其特征在于步骤S2中所述的以所提取的总RNA为模板，进行反转录反应，具体方法如下 521.配制反应体系20μ L，包括RNA模板I μ 1，5倍反应缓冲液4 μ L，浓度为10 mmol/L的dNTP 2 μ L，浓度为IOU/ μ L的RNA酶抑制剂2 μ L，浓度为25 μ mo I/L的随机弓丨物I μ L，浓度为5U/ μ L的反转录酶2 μ L，添加去RNA酶水至总体积20 μ L ; 上述的 5 倍反应缓冲液由 ρΗ=8· 3 的 Tris-HCl 250 mmol/L,KCl 375 mmol/L,MgCl2 40mmol/L 和 DTT 50 mmol/L 组成而得； 522.轻微混匀通过上述步骤S21所得的反应液，于室温放置10min后移入42°C恒温槽中保温I h ； 523.将经过上述步骤S22的反应液于冰水中冷却2min完成反转录反应，获得待测罗非鱼血液样品的cDNA。
4.根据权利要求I所述的一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，其特征在于步骤S3中所述的引物是根据GenBank数据库提供的无乳链球菌的cfb基因序列，并结合环介导等温扩增技术的原理设计并合成，分别是PI: 5-ATGAACGTTACACATATGATGT-3 ；P2: 5-GTTCCCTGAACATTATCTTTGA-3 ；P3: 5-TCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGATCTATCTGGAACTCTAGTGG-3 ；P4: 5-AGTGACAACTCCACAAGTGGTAGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAG-3。
5.根据权利要求I所述的一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，其特征在于步骤S4中所述的目标基因的环介导等温扩增的具体方法如下 541.配制反应体系25μ L，包括10倍反应缓冲液2. 5 μ L，浓度为25mmol/L的MgSO44 μ L、浓度为IOmmoI/L的dNTP 4 μ L，浓度为20ymol/L的引物Pl和P2各I. 5 μ L，浓度为10 μ mo I/L的引物P3和P4各O. 5 μ L，浓度为8U/ μ L的Bst DNA聚合酶大片段I μ L，步骤S2中获得的cDNA模板2 μ L，添加ddH20至总体积25 μ L ；上述上 10 倍反应缓冲液由 ρΗ=8· 8 的 Tris-HCl 200mmol/L, KCl 100 mmol/L, (NH4)2SO4100 mmol/L, MgSO4 20 mmol /L 和 TritonX-100 1%组成而得; 542.轻微混匀通过上述步骤S41所得的反应液，于65°C保温Ih ； 543.将经过上述步骤S42的反应液于80°C保温IOmin以终止反应。
6.根据权利要求I所述的一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，其特征在于步骤S5中所述的扩增完成后，检测反应结果的方式为直接用肉眼观察反应结果，若步骤S4中的反应体系中出现白色沉淀者为阳性，说明血液样品中含有无乳链球菌，即表示带检罗非鱼已受到无乳链球菌的感染。
7.根据权利要求I所述的一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，其特征在于步骤S5中所述的扩增完成后，检测反应结果的方式为使用DNA染料SYBR Green I染料进行染色，即向步骤S4中的反应液中加入SYBR Green I I μ L，若反应体系在紫外灯下出现绿色荧光为阳性，说明血液样品中含有无乳链球菌，即表示带检罗非鱼已受到无乳链球菌的感染。
8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，其特征在于该方法不经过细菌的培养，直接以罗非鱼血液为样本进行检测。
全文摘要
一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，涉及一种无乳链球菌的检测方法，本发明以无乳链球菌cfb基因为检测对象，通过检测罗非鱼血液中是否存在无乳链球菌cfb基因，从而判断被检罗非鱼是否受到了无乳链球菌感染。本方法通过反转录的方法将菌体内单拷贝的cfb基因转变为多拷贝，再通过环介导等温扩增技术对目标基因进行检测，从而大大提高检测灵敏度。该方法能在感染初期快速、特异、简便的检出罗非鱼体内的无乳链球菌，为罗非鱼链球菌病的预防提供新的技术手段。
文档编号C12Q1/14GK102888458SQ20121036810
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者易弋, 杨军, 黄稀, 黎娅, 伍时华, 罗福广, 左跃 申请人:广西工学院, 柳州市鱼家乐饲料有限公司