专利名称：以 Wnt为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及一种以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有组成型fct活性细胞为基础的药物筛选细胞模型；本发明同时还涉及该药物筛选细胞模型的构建方法和应用。
背景技术：
Wnt是一条进化上高度保守的信号通路，从线虫到人类，均有Wnt家族成员存在。果蝇含有7种Wnt基因，而在脊椎动物中含有19种。通过小鼠体内β-catenin(CTNNBl)功能缺陷和功能获得性的试验证实，在胚胎发育早期的各个阶段，Wnt家族成员直接决定着细胞的分化方向，同时也调节了诸如心血管、中枢神经系统、肾脏和肺等组织器官的分化发展。在成人体内，fct信号通过调节干细胞的分化来维持组织自我更新。然而，Wnt信号通路的异常活化，常常导致人类的发育缺陷、癌症及各种疾病。·1993年，Vogelstein报道了肿瘤抑制因子APC可以与Wnt通路核心成员β -catenin相互作用，肿瘤与Wnt信号通路之间的关联才逐渐为人们所知。在过去19年的研究中，人们发现fct信号通路是多种恶性肿瘤发生的共同途径。在诸如结肠癌、黑色素瘤、毛母质瘤、肝癌、成神经管细胞瘤、肝母细胞瘤、胃肠癌、韦氏肿瘤等超过3500多种不同癌症中，病变组织中均能检测到CTNNBl的突变或 Wnt信号通路的异常活化。统计发现，超过有超过700个病例的CTNNBl突变发生在β -catenin的N端，这些突变或者改变了 β-catenin磷酸化的位点Ser45、Thr41、Ser37和Ser33,或者改变了与这些位点相邻的其他氨基酸。Wnt信号通路相关基因APC，AXINl，AXIN2和CTNNBl的突变直接导致了细胞质内β -catenin的积累，过剩的β -catenin入核转录Wnt下游基因，导致组织细胞恶性增殖，引发癌症。在绝大部分结肠癌和消化系统癌症中，都能检测到APC、AXIN或者CTNNBl基因的突变。在结肠癌Wnt信号通路异常活化的病例中，将近80%是由APC基因的突变或缺失造成的。在肝癌的病例中，良性肝细胞腺瘤中若出现 fct信号通路的异常，将大大增加其转变为恶性肝癌的风险。不同于结肠癌的是，恶性肝癌中APC突变发生的概率很低，而CTNNBl和AXINl基因的突变更为常见。这些突变阻断了 β-catenin被磷酸化及泛素化修饰的途径，打破了体内的动态平衡，使β-catenin得以积累并入核，最终导致细胞的恶性增殖或分化。基于上述原因，一直以来研究者们试图寻找特异性好，副作用低的Wnt抑制剂，以最终用于临床，缓解和治疗数目庞大的相关患者；然而时至今日理想的产品少之又少，很大程度缘于没有一套高效而简易的筛选方法；基于报告系统的高通量筛选方法虽已经出现并用于实践，取得了一定成效，但仍然有一些不可克服的缺点，比如需要外源刺激(先用激活剂激活fct，再去筛选抑制剂)，这样不仅步骤多，而且筛选成本也较高，尤其是像细胞因子Wnt3 等激活剂的使用将大大增高成本；即使像Licl类激活剂使用成本较低，但由于其本身毒性较大，限制了其使用；同时筛选体系每增加一步，会使报告系统的不稳定性增加(额外的操作必然会带来额外的不确定因素)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种以fct为靶点的药物筛选细胞模型。本发明的另一目的是提供一种以fct为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法。本发明还有一个目的，就是提供以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型在药物筛选中的应用。(一)以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型药物筛选细胞模型
本发明以fct为靶点的药物筛选细胞模型，是利用含有β -catenin特异性结合序列的 报告系统载体，以具有组成型fct的活性细胞为基础，构建成稳定的以Wnt信号为靶点的高通量药物筛选细胞模型。所述β-catenin的特异性结合序列为5’ -AGATCAAAGGG-3’。所述报告系统载体是在含有突光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有β-catenin特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。所述具有组成型Wnt活性细胞为一类具有持续活化Wnt活性的细胞,主要有DLDl前列腺癌细胞、Hep3B人肝癌细胞、HCTl 16人结肠癌细胞等。(二)以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型药物筛选细胞模型的构建方法 本发明以fct为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法，包括以下工艺步骤
(1)报告系统载体构建利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有β-catenin特异性结合序列以及3’端含有TATA盒序列的DNA片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。这样插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当β -catenin活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；抑制β-catenin活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的水平都降低，也就抑制细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就减弱。(2)细胞模型的构建将所述报告系统载体转染具有组成型Wnt的活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对已知fct信号抑制剂(如XAV939，LDW643等已知Wnt上游信号抑制剂)有响应的克隆，即为以fct为靶点的药物筛选细胞模型。在具有组成型Wnt活性的细胞中，报告系统载体能很好地被活化。当使用Wnt信号通路抑制剂时即可使荧光被显著抑制，构建的细胞模型也就无需在外源刺激下灵敏地用于高通量药物筛选。(三)以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型的应用
本发明以fct为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由Wnt组成型活化造成的肿瘤抑制药物。具体药物筛选方法如下
(O将所述药物筛选细胞模型用100 I培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为 50% 60% ；
(2)培养基中加入待筛选化合物O.I μ Γ2Ρ I，继续培养24小时；(3)在96孔板中加入50P I稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；
(4)以化合物细胞毒性实验消除初筛产物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率仍在40%以上得到复筛产物，即为以Wnt为靶点的抑制剂。本发明相对于现有技术具有以下优点以Wnt信号通路为靶点，采用基于具有组成型Wnt活性(即持续Wnt活性)的细胞系为策略，使报告系统本身在细胞中处于高度活化状态，无需使用外加刺激，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选；不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从细胞培养一激活fct —加化合物一检测简化为细胞培养一加化合物一检测，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升系统稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。
图I为所用报告载体基本骨架；
图2为所构建的报告系统载体Wnt -Iuc插入序列的测序结果 图3为利用293T细胞检测报告系统载体Wnt - Iuc响应能力；
图4为使用Western-Blot方法检测本发明所涉及的细胞中β-catenin活性结果； 图5为利用！fep3B细胞检测报告系统载体Wnt - Iuc响应能力；
图6为利用DLDl细胞检测报告系统载体Wnt - Iuc响应能力；
图7为利用DLDl-W筛选得到产物对β -catenin信号的抑制。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型的结构、构建方法和应用做进一步说明。实验中所采用的仪器和试剂如下
仪器PerkinElmer Victor3突光/化学发光分析仪。试剂萤火虫荧光素酶测定试剂盒购自Promega公司；XAV939以及嘌呤霉素购自Sigma-Aldrich公司；用于筛药的96孔板购自Corning公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；序列合成及测序,上海生工提供；DMEM (高糖)及胎牛血清购自Hyclone (Thermo公司),转染试剂GenEscort II购自南京慧基生物；筛选的化合物由国家小分子化合物资源中心提供；各种抗体购自Cell Signaling Technology公司。I、报告系统载体构建
利用同尾酶技术得以快速准确获得任意倍数的TCF结合序列，从而选取能够有效响应fct信号的最佳拷贝次数构建报告系统。将人工合成包含9个TCF的结合序列(5，-AGATCAAAGGG-3，)以及通用的TATA盒辅助序5’-TATATAA-3’的DNA片段，以KpnI和HINDIII的酶切位点插入到通用的荧光素酶报告载体pBR322-luc-puro,得到的报告系统载体命名为Wnt_luc。突光素酶报告载体 81 322-111^111'0由？81 322载体出11(1111和3&1 I之间插入北美萤火虫荧光素酶(FireflyLuciferase，参见J R de Wet等人Mol. Cell. Biol. 1987)报告基因和嘌呤霉素基因(Puromycin,参见 Lacalle RA 等人Gene. 1989，GenBank: M25346. I)所得，并且突光素酶报告基因和嘌呤霉素筛选基因通过内部核糖体进入序列(IRES)相连，pBR322-luc-puro多克隆位点位于原EcoR I和Hind III之间(参见图I)。至此，在pGL4. 20-luc-puro荧光素酶报告载体上的完整插入序列如下(测序结果参见图2)
5'^KfTACC AC ATf^\AA^ CM；；GTCGΛC,%GAT(^AΛ ACiCIGCRlTA AG ATC* AA ACiCiCiC
TCOACA<；AlTA%,L4GC iGC3TAAC^\TC；A\AGCiG(1X'GAC^%CiATt,A,,L%CJ iiGGTAAii
AU'ΛΛΜMiHiCJCGAlM^XlVAAAt； ；1}ΙΠ Λ Α 'XXMMiQClCGAQ -5'.
2、报告系统载体性能测试ΗΕΚ293Τ细胞于12孔板生长，当细胞汇合度为50% 60%时，转染Wnt_luc(2 Hg/孔)，载体与转染试剂的使用比例为1:2(即2 Il g质粒，4 μ I转染试剂，各溶于50 P I DMEM无血清培养基，混合成100 P I预混液，室温静置20 min，再加入150 P I无血清DMEM，混匀后加入12孔板各孔内)4小时后换成完全培养基(即含有10%胎牛血清的DMEM培养基)，12小时以后，用LiCl (25mM)处理8小时，吸去培养基，加入200 Ul裂解液裂解细胞，轻摇 lOmin，取150 μ I于96孔板中，加入20 μ I普通萤火虫荧光素酶底物,使用荧光/化学发光分析仪立即测定(Imin以内)荧光素酶的活性，对照及处理各3个重复。由于ΗΕΚ293Τ细胞对各种外源细胞因子的刺激比较敏感，便于在外加细胞因子刺激时检测相应信号通路的活化情况。所以使用该细胞作为代表检测报告系统载体是否响应正常。ΗΕΚ293Τ细胞中Wnt信号使用LiCl刺激激活，结果表明在信号通路活化时所使用报告系统载体9Χ Wnt-Iuc以及对照的4X、7X Wnt-Iuc响应正常，刺激后与刺激前荧光素酶活性的比例分别为811: I、135: I、170: 1，可见9Χ Wnt-Iuc响应能力最好(见图3，其中control为对照)。3、药物筛选模型构建及性能测试
选用其中DLDl细胞将Wnt-Iuc转染DLDl细胞(IOcm培养皿)48小时后，I传3，并加入嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，初始浓度为5 P g/ml, 2周后降为2.5 Pg/ml,待形成克隆(共约3周)后，用胰酶消化单克隆于96孔板，长起后再转入48孔板，6孔板直至IOcm培养皿和冻存，期间用浓度为2.5 H g/ml的嘌呤霉素继续维持2周。首先选取荧光素酶阳性的克隆，再检测这些克隆是否响应正常，由于即使组成型活化，信号通路一般还能对外加细胞因子有所反应，故所选阳性克隆的荧光素酶活性在细胞因子刺激时应当还能有所增加；并且由于是组成型活化，Wnt信号通路的抑制剂应当能使荧光素酶的活性减少，经筛选最终得到反应比较理想的细胞株，命名为DLDI-W。图4为使用Western-Blot方法检测DLDl及Hep3B中β -catenin表达情况，以HEK293T为对照。图5及图6为DLD-I和!fep3B细胞检测报告系统载体Wnt - Iuc响应能力，以无响应元件的空载体作为对照，发现DLD-I和Hep3B细胞中的β -catenin信号较高，故这里选用DLDl细胞(图5、6中control为对照)。4、模型的应用
(1)将所述药物筛选细胞模型(DLDl-W)用100μ I培养基接种于96孔板中(10，000个/孔)，培养至细胞汇合度为30% 40% ；
(2)培养基中加入待筛选化合物0.I P Γ2Ρ I，继续培养24小时；(3)在96孔板中加入50P I稳定型荧光素酶底物，使用荧光或化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；
(4)以化合物细胞毒性实验消除初筛产物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率仍在40%以上得到的复筛产物，即为以fct为靶点的抑制药物。所选用的阳性对照抑制剂XAV939为已知Wnt信号通路的抑制剂，作用于Wnt上游Tankyrase-I和Tankyrase-2,最终减少Wnt活化,选用的XAV939 (100 PM)浓度经MTT实验证实对DLDl细胞无明显生长抑制(24小时)。图7为利用DLDl-W筛选得到的其中两种产物ICBDS05和ICBDS10对β -catenin信号的抑制，以XAV939 (100, M)作为阳性对照，其中control为对照。上述实验证明，通过以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型复筛得到的化合物确为以Wnt为靶点的抑制药物，从而证明该药物筛选细胞模型的有效性。 大量实验还表明，在多种具有组成型Wnt活性的细胞中，本发明以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型都能取得便捷、快速、高效的筛选效果。
权利要求
1.以fct为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于利用含有β-catenin特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型fct的活性细胞为基础，构建成稳定的以Wnt信号为靶点的高通量药物筛选细胞模型。
2.如权利要求I所述以fct为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于所述β -catenin的特异性结合序列为5’ -AGATCAAAGGG-3’。
3.如权利要求I所述以fct为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于所述报告系统载体是在含有突光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有β-catenin特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。
4.如权利要求I所述以fct为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于所述具有组成型fct的活性细胞为DLDl前列腺癌细胞、Hep3B人肝癌细胞、HCTl 16人结肠癌细胞。
5.如权利要求I所述以fct为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法，包括以下工艺步骤 (1)报告系统载体构建利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有β-catenin特异性结合序列以及3’端含有TATA盒序列的DNA片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体； (2)细胞模型的构建将所述报告系统载体转染具有组成型Wnt的活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对Wnt信号抑制剂有响应的克隆，即为以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型。
6.如权利要求I所述以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由Wnt组成型活化造成的肿瘤治疗药物。
7.如权利要求6所述以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由Wnt组成型活化造成的肿瘤抑制药物，其特征在于所述药物筛选的方法如下 (I ) 将所述药物筛选细胞模型用I O Oμ I培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为50°/Γ60% ； (2)培养基中加入待筛选化合物O.I μ Γ2 μ 1，继续培养24小时； (3)在上述96孔板中加入50μ I稳定型突光素酶底物,使用突光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物； (4)以化合物细胞毒性实验消除初筛产物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率仍在40%以上得到复筛产物，即为以Wnt为靶点的肿瘤抑制药物。
全文摘要
本发明提供一种以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型，利用含有Wnt特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型Wnt的活性细胞为基础构建而成。该模型用于筛选由Wnt组成型活化造成的肿瘤及免疫疾病的治疗药物，由于采用具有组成型Wnt活性的细胞，模型细胞中报告基因处于高度活化状态，无需使用外加刺激物，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选；不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从细胞培养→激活Wnt→加化合物→检测简化为细胞培养→加化合物→检测，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升系统稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。
文档编号C12N5/10GK102965340SQ20121036860
公开日2013年3月13日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者赵晨阳, 李博, 马银杏, 王勤, 杨金波 申请人:白银博赛宁生物科技有限公司