高血压易感性无创检测试剂盒（gnb3等基因）的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种检测高血压易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测GNB3基因上C825T(rs5443)、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、TGF-Β1基因上T869C(rs1982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与高血压发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型从基因层面来评估高血压发病的风险级别，指导人群提早预防疾病发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
【专利说明】高血压易感性无创检测试剂盒(GNB3等基因)
【技术领域】
[0001]本项目属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种高血压易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估高血压发病的风险级别，并作为预防和治疗高血压的方向指导。
【背景技术】
[0002]高血压是指在静息状态下动脉收缩压和/或舒张压增高为主要临床表现的综合症，可分为病因不明的原发性高血压和由明确独立疾病所引起的继发性高血压。其中，原发性高血压患者占高血压患者总数的95%以上。有调查结果显示，59%的原发性高血压患者都有家族史，说明遗传因素对于高血压的发生具有重要影响。长期高血压是造成心脑血管疾病死亡的重要原因。因此开发出一种高效、便捷的高血压易感性检测技术将对于预防和治疗高血压具有积极的意义。目前已经有研究表明G蛋白β3亚基(GNB3)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和转化生长因子β I (TGFβ I)等基因的多态性均与高血压的易感性有直接关联，在预防和治疗高血压中具有一定的预测价值。
[0003]G蛋白是一种重要的细胞信号转导蛋白，在细胞膜受体和效应蛋白间的信号传递中起着重要的中介作用。GNB3的第825位C — T突变(C825T)会导致表达产生一个截短型的但是具有功能活性的剪接变异体GNB3s。在高加索人群中携带有825Τ等位基因的人患高血压的危险性显著增加。在汉族人群的单基因分析中尚未发现GNB3基因C825T基因多态性与高血压的直接相关性，但是在GNB3基因235Τ等位基因携带者中却发现GNB3基因825Τ等位基因会显著增加高血压的发病危险。因此GNB3基因825Τ等位基因被认为是高血压发病的一个危险因素。`
[0004]MTHFR是同型半胱氨酸(Hcy)代谢途径中的关键酶。MTHFR基因的第677位C — T突变(C677T)会使其编码的氨基酸从丙氨酸变为缬氨酸，从而影响酶的活性及热稳定性并使血浆中Hcy浓度升高，而Hcy水平的升高与高血压的发病密切相关。研究显示原发性高血压患者中MTHFR基因C677T位点的TT基因型频率和T等位基因频率均高于正常人群且677ΤΤ基因型对Hcy型高血压的发病危险有显著贡献。因此MTHFR是高血压发病的一个易感基因。
[0005]TGF^ I是具有多种生物活性的细胞因子，可调控内皮素生成并影响肾素-血管紧张素系统使血压升高，在介导心血管疾病的发生中起着重要的作用。研究发现TGFii I第869位T — C突变(T869C)可使TGF0 I的血清水平上升并且在高血压患者中C等位基因频率有显著增高。因此认为TGF β I基因的869C等位基因是通过上调了 TGF β I的表达水平而增加了高血压的发病风险，是高血压发病的一个危险因素。
[0006]综上所述，鉴于GNB3基因、MTHFR基因和TGF^ I基因在高血压疾病中体现出来的疾病相关性，可以通过检测这些高血压发生相关基因单核苷酸位点基因型及时筛查出易患高血压的高危人群，从而有针对性地预防和治疗，这对于降低高血压的发病率有非常重要的意义。
【发明内容】
[0007]基于GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估高血压发病风险级另O，本发明提供一种高血压基因无创检测试剂盒。
[0008]该试剂盒包括:
检测 GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)。
[0009]PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0010]DNA测序反应组件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0011]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0012]PCR 产物纯化体 系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
.3.875ul。
[0013]测序反应体系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0014]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0016]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0017]实施例1.检测试剂盒的使用。
[0018]1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0019]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(1)GNB3 (C825T )正向引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’
GNB3 (C825T)反向引物:5’AAATGCCAGGAACCCAGAA3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3 ) TGF- B I (T869C)正向引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
TGF- B I (T869C)反向引物:5’ GCTTCCGCTTCACCAGCT3’。[0020]PCR扩增的反应体系为:10 X PCR反应缓冲液2.5ul ；25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq酶0.125ul、DNA模板lul (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ul、ddH20 19.175ul。
[0021]反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0022]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0023]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0024]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)GNB3 (C825T)测序引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’
(2)MTHFR (C677T)测序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(3)TGF-B I (T869C)测序引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0025]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0026]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0027]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0028]实施例2.为人群进行预防高血压基因无创检测的服务。
[0029]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0030]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的GNB3基因上C825T (rs5443) ,MTHFR基因上C677T(rsl801133)、TGF-B I基因上T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0031]3.高血压高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具高血压风险评估分析报告单。报告中详细说明7受检者 GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF- B I 基因上T869C (rsl982073)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读高血压基因无创检测报告单。
【权利要求】
1.一种筛查高血压高危人群的基因无创检测试剂盒，其特征在于:检测GNB3基因上C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上 T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性引物对是指针对GNB3基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF- B I 基因上 T869C(rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的DNA测序引物是针对GNB3基因上C825T (rs5443)、MTHFR基因上C677T (rsl801133)、TGF_B I 基因上T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下:
(I) GNB3 (C825T )正向引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’ GNB3 (C825T)反向引物:5’AAATGCCAGGAACCCAGAA3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3)TGF- B I (T869C)正向引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’ TGF- B I (T869C)反向引物:5’ GCTTCCGCTTCACCAGCT3’。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下: (1)GNB3 (C825T)测序引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’ (2)MTHFR (C677T)测序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ (3)TGF-B I (T869C)测序引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括: (1)?0?反应体系:10父？0?反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 产物纯化体系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)测序反应体系:25%BigDye mixlul, 3.2uM DNA测序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
【文档编号】C12Q1/68GK103710425SQ201210373802
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年10月2日 优先权日:2012年10月2日
【发明者】石慧林 申请人:解码（上海）生物医药科技有限公司