专利名称：重组工程介导的定点突变方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种高效的运用重组工程手段实现定点突变的方法。
背景技术：
定点突变是指运用分子生物学手段将蛋白质特定位点的氨基酸改变为另外一个氨基酸。由于直接对蛋白质进行操作非常困难，故首先在基因(DNA)水平对碱基进行改变，突变的基因即编码突变的蛋白质。定点突变是研究基因和蛋白质的结构和功能以及获得高品质的催化用酶的重要途径，属于分子生物学研究的常用手段。自利用dUTP酶缺陷型菌株进行定点突变的Kunkel法以来，已发展了多种对克隆于载体上的基因的进行定点突变的方法，常用的有以下两种。 第一种方法是以美国Stratagene公司的定点突变试剂盒所采用方法为代表的寡核苷酸法。具体过程是首先以突变的寡核苷酸和PCR法扩增得到含突变位点的完整质粒，通过DpnI酶切去除甲基化的模板后，将PCR扩增产物转化至大肠杆菌的宿主菌，再筛选得到定点突变的克隆。本方法的缺点是需要PCR扩增较大的载体部分，虽然近年来高保真、扩增大片段的PCR酶类发展较快，但扩增数kb的载体的效率和高保真度仍然不能保证。此夕卜，试剂盒的昂贵价格(1000元以上)也是一个制约因素。第二种方法为重叠一延伸PCR (OE-PCR)和克隆相结合的技术。其特点是设计两个互补的、含突变位点的引物。具体过程是首先扩增含突变位点的上游片段和含突变位点的下游片段，随后以两个片段为模板，通过OE-PCR得到含突变位点的融合片段。融合片段的两侧设计有限制性内切酶的酶切位点，酶切融合片段后克隆至同样酶切的载体上，最后通过筛选得到定点突变的重组克隆。本方法的缺点是OE-PCR方法有时候延伸不能进行，而且涉及一系列的基因克隆步骤，即经过限制性内切酶的酶切、与表达载体的连接、连接产物转化表达宿主菌等操作步骤。其他的方法如大引物法和多重寡核苷酸法一般为上述方法的衍生，具有类似的克隆步骤，均操作烦琐，耗时长，突变率低。
发明内容
为克服上述不足，本发明申请提出了一种基于重组工程的定点突变方法。重组工程是上世纪九十年代末发展起来的一种利用重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而进行DNA克隆和修饰的基因工程技术。现均利用来源于lambda噬菌体的重组酶Exo，Beta和Gam，Exo为5’ ->3’ DNA外切酶，其作用于双链DNA得到3’端突出的DNA分子；Beta为DNA单链结合蛋白，其结合在突出的DNA分子上保护单链DNA免于宿主单链核酸酶的降解，Beta行使重组酶的活性，即催化单链DNA分子在复制叉处退火而发生同源重组。Gam蛋白可保护外源的双链修饰DNA片段免受宿主双链核酸酶的降解。本方法的所提出的重组工程介导的定点突变的基本原理是是采用PCR的方法引入突变，再将突变的DNA通过重组工程酶催化的同源重组而获得发生定点突变的重组克隆，以附图的实施例中对克隆在表达载体pET30a(+)中的nanA基因进行定点突变的实验步骤进行说明。本发明所采用的技术方案包括以下步骤
(O首先以克隆nanA基因的质粒pLS2042为模板，Pl和P2扩增得到突变位点之前的50bp同源臂、突变位点和突变位点之后nanA基因片段。以pKD4为模板，P3和P4扩增得到β-内酰胺酶抗性基因(bla)。其次，以上述两个片段为模板，通过0E-PCR，P5和P6扩增得到融合的DNA修饰片段。此DNA修饰片段依次由下列结构组成与克隆在质粒上的待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、靶基因突变位点的下游片段、与质粒所含的抗性基因不同的另外一个抗性基因和载体所含的抗性基因下游的50bp右端同源臂；
(2)将克隆靶基因的质粒转化基因染色体的重组工程菌株LS-GR(大肠埃希氏菌CGMCCNo. 3192)；
(3)将步骤(I)得到的DNA修饰片段电转化至以终浓度为O.2%的L-阿拉伯糖诱导下表达Red重组酶基因的步骤(2)的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源臂和质粒上相同序列之间的同源重组，将所述DNA修饰片段中，左右50bp同源臂之间的片段取代质粒上两个同源臂之间的片段。直接获得靶位点发生定点突变，原质粒上的抗性基因被修饰片段做携带的抗性基因所取代的重组克隆。本发明中所述的靶位点，可以是一个或数个碱基，相应地，突变位点也可以是一个或数个碱基。重组酶基因选择是来自于lambda卩遼菌体的exo,bet和gam,这三个重组酶基因之下克隆有来源于大肠杆菌的recA基因，本发明中所使用的基于染色体的重组工程系统为重组酶基因和recA基因整合至大肠杆菌DHlOB所得的菌株LS-GR。LS-GR在L-阿拉伯糖诱导下表达red重组酶基因，recA基因增加重组活性。实施例中的PLS2042是蛋白表达质粒，可在IPTG (异丙基-β-D -硫代半乳糖苷)诱导之下表达目标蛋白。因此突变的重组克隆可直接用于表达突变体蛋白。选择PKD4为模板扩增是bla因为pKD4使用R6K复制子，其复制需要宿主菌提供pir基因，而常规的大肠杆菌菌株不含有Pir基因，这就意味着以pKD4为模板所得到的产物再转化如本申请中所使用的大肠杆菌DHlOB衍生的LS-GR菌株就不会有质粒的干扰，否则微量环状质粒的存在就会得到大量的抗性菌落背景，而导致目标重组克隆难以筛选。由于目前重组的效率一般在1χ10_4之下，为避免未发生重组的质粒的巨大背景，引入一个新的抗性基因以采用与原质粒不同的抗生素进行抗性筛选，这样只有发生重组的菌株才能生存。使用短引物进行OE-PCR的优点在于减少了长引物可能引入的碱基突变、确保只用正确的片段才能够被扩增，而且与长引物相比，短引物增加了 PCR的扩增效率。使用融合片段而非两个单独的片段非常关键，否则单个的抗性基因片段(即P3和P4扩增得到的产物)可能和质粒上的同源片段进行同源重组而得到很大的抗性克隆的背景而不能得到突变克隆。如突变位点与克隆位点相距不远(一般小于500个碱基)。则可以使用载体的通用引物进行测序。本专利申请中的突变位点与克隆位点相距较远，故以设计的引物进行重组克隆的测序。随着碱基合成的价格不断下降以及准确度的不断提高，本突变方法的价格将克隆进一步的降低，多位点突变的效率也可能有所提高。对一个基因不同位点的突变可使用多个相同的引物，如本专利申请的实施例2中的NanA的S208G突变即使用了与E192N点突变相同的5个引物，即R552、R553、R554、R562和R566，只有突变引物有所不同，这样就大幅度地减少了费用支出。优选实施例是对来源于大肠杆菌的醛缩酶基因nanA进行定点突变，醛缩酶是酶法催化生成神经氨酸的二步催化反应中的第二个酶。神经氨酸是抗流感药物扎那米韦的关键中间体，也是合成神经氨酸酶抑制剂类化合物的重要原料以及婴幼儿奶粉等食品的营养成分，目前价格昂贵(>2万/公斤)。高活性的醛缩酶突变体将有助于开发高效的催化工艺，以降低神经氨酸的生产成本，因此有着巨大的经济价值。nanA在MG1655基因组上的基因编号是b3225，突变位点选择三个碱基位点和一 个碱基位点。三个碱基位点的定点突变是开放阅读框的第574-576位碱基GAA突变为AAC(尽管中间的一个碱基未改变，但从同源重组的原理上来说是突变了三个碱基)，这使得第192位的谷氨酸突变为天冬酰胺(E192N)。单个碱基位点的定点突变是开放阅读框的第622的碱基A突变为G，这使得第208位的氨基酸丝氨酸密码子AGT突变为GGT，即丝氨酸突变为甘氨酸(S208G)。E192和S208均位于NanA的活性区域，两个突变有利于酶法生成神经氨酸以及扎那米韦的衍生物。实验证明单个寡核苷酸突变的效率可达100%，连续突变三个核苷酸的效率可达45%。两个定点突变实验的成功充分证明了本发明方法的可行性和较常规方法的优越性。重组工程大大简化了基因工程的操作，本方法简便快捷，无须任何特殊的设备材料，通过PCR、转化和筛选的实验步骤就直接得到定点突变的重组克隆，无需繁杂耗时的基因克隆步骤。高突变效率意味着只要筛选几个克隆即得到目标突变。因此本方法可能成为通用的定点突变的方法，将有着广泛的应用并显示出着良好的经济前景。
图I是本发明所采用的方法的示意图。图2是nanA基因E192N突变位点区域的测序图；图的上部分和下部分分别为以R566为测序引物，对原始质粒pLS2042和重
组质粒PLS2043进行测序的结果。可见在测序图谱中，pLS2042的E192所对应第121-124位的GAA突变为在pLS2043中第135-137位的AAC。图3是nanA基因S208G突变位点区域的测序图；图的上部分和下部分分别为以R566为测序引物，对原始质粒pLS2042和重组质粒pLS2044进行测序的结果。可见在测序图谱中，PLS2042的S208所对应
第169位的A突变为在pLS2044中第179位的G。注在图2和图3的测序图谱中，由于质粒的不同，测序信号显示的起始位点可能不同，但可见除突变位点的序列之外，其余的序列完全相同。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒
I.Escherichia coli MG1655。基因型F LAM- rph-Ι,来自美国大肠杆菌保藏中心。 2. Escherichia ColiDHlOB0 基因型 FicrA Δmrr~hsOrRMSBC)Φ 80cL/acZ Δ M15 Δ 7acX74 deoR reckl araD139 t^ara, leu) 7697 galM gaVk rpsL endklnupG.。文献Life Technologies, Inc. Focus, 1990, 12:19。购自美国 Invitrogen 公司。3. pET30a(+)。基因表达载体,购自美国Novagen公司。4. pKD4。 文献Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl AcadSci USA. 2000, 97(12) : 6640-5。来自美国 Purdue 大学 Barry Wanner 的教授。5. LS-GR0 是大肠埃希氏菌(fccAericAia coli) CGMCC No. 3192，在第200910184219. O号中国专利申请中已公开。本发明的方法示意图如图1，图中各符号的意义如下。nanA是神经氨酸醛缩酶基因；nanA*表不突变后的基因；捕圆点表不突变喊基；kan表不卡那霉素抗性；Ap表不是氨苄青霉素抗性；H1和H2分别表示Pl和P4中的同源臂；λ -Red表示重组工程；双交叉号表示重组工程介导的同源重组；Ap表示以氨苄青霉素进行筛选；PCR表示聚合酶链式反应；0E-PCR表示重叠一延伸聚合酶链式反应。Pl至P6为PCR引物，Pl由突变位点之前的50bp序列(同源臂)、突变位点(单个或多个)和突变位点之后的扩增引物做组成；P2由针对靶基因之后序列(一般选择多克隆位点之后的通用引物序列，这样如筛选大量克隆，则可以首先采用通用引物进行测序)和扩增与原载体的抗性基因所不同的另外一个抗性基因的3’端引物所组成；P3为P2的反向互补序列；P4为原载体的抗性基因之后的50bp序列(同源臂)和扩增另外一个抗性基因的5’端引物所组成；P5为Pl前端约21个碱基的序列；P6为P2前端约21个碱基的序列。简要的实验过程是P1和P2扩增出含同源臂和突变位点的片段，P3和P4扩增出氨苄青霉素抗性基因片段，以这两个片段为模板，P5和P6通过OE-PCR扩增出含同源臂、突变位点和抗性基因的融合片段。此电转化至表达重组酶的、含有克隆靶基因的载体PLS2042的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重组酶催化的同源臂之间的同源重组，融合片段取代了原质粒上两个同源臂之间的部分，在氨苄青霉素抗性筛选之下得到了发生的定点突变，且原卡那霉素抗性基因被新引入的氨苄青霉素抗性基因所取代的重组克隆。实施例I. nanA表达载体的构建
设计引物 ALl :5’ -GGGGGATCCATGGCAACGAATTTACGTGGC-3’，(SEQ ID NO. I) ；AL2 :5’ -GGGAAGCTTTCACCCGCGCTCTTGCATCAAC-3’，(SEQ ID NO. 2)，所分别引入的 BamHI 和 HindIII 酶切位点以下划线表示。以大肠杆菌原株MG1655的基因组DNA为模板，AL1-AL2扩增得到O. 9kb 的 nanA 基因，O. 9kb 经 BamHI-HindIII 酶切后克隆至 pET30a(+)的 BamHI-HindIII位点得到大肠杆菌醛缩酶表达载体PLS2042。实施例2 nanA基因E192N的定点突变
I.表达Red重组酶基因的大肠杆菌感受态细胞的制备和转化将pLS2042转化至LS-GR，以25 μ g/ml的庆大霉素和30 μ g/ml的卡那霉素筛选之下，得到菌株LS-GR/pLS2042。将所得菌株单菌落接种至3ml含25 μ g/ml的庆大霉素和30 μ g/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，37°C振荡过夜，以1/50体积转至50 ml相同抗性的LB液体培养基中，振荡培养至菌体OD6tltl约为O. 2时，加入终浓度为O. 2%的L-阿拉伯糖以诱导重组酶，继续培养至0D_约为O. 4，将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟，4°C，5000rpm离心5分钟，弃上清。以冰冷的10%甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于200 μ I冰冷的10%甘油中，每管50 μ I分装。 将融合的修饰DNA片段加至电转化感受态细胞中，轻弹混匀后转移至冰上预冷的Imm电转杯中进行电击转化。电转化条件美国Bio-Rad公司Gene Pulser IIe电转化仪，1800 ν，200Ω。电击后，加入Iml SOC液体培养基，吹打混匀后，
转移至一个无菌的I. 5ml离心管中，37°C振荡培养2小时，涂布在含50 μ g/ml氨苄青霉素的抗性平板上，37°C培养。挑取单菌落，以含50 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，提取质粒，测序验证其突变。基因E192N的定点突变
设计弓I物 R551 :5’- agcagatccgtcgtgaacatcctgatcttgtgctctataacggttacgac^CMCTTCGCCTCTGGTCTGCTG-3’，(SEQ ID NO. 3)，在此引物中，靶位点上游的50bp同源臂以小写字母表示，突变位点以斜体字母表示，扩增引物以下划线字母表示；R552 :5’-GGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAATGCTAGTTATTG
CTCAGCGGTG-3，，(SEQ ID NO. 4)，在此引物中，前端27个碱基为bla基因3’端27个碱基的反应互补序列，扩增PLS2042中的T7终止子序列的后端23个喊基以下划线字母表不；R553 :5，-CACCGCTGAGCAATAACTAGCATTTACCAA
TGCTTAATCAGTGAGGCACC-3，，(SEQ ID NO. 5)，R553 为 R552 的反向互补序列，扩增 bla基因3’端的27个碱基以下划线字母表示；R554 :5’ - ctttgatcttttctac
RRRRtctRacRctcaRtRRaacRaaaactcacRtGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG-S' ， (SEQ IDNO. 6)，在此引物中，50bp同源臂以小写字母表示，针对的是卡那霉素抗性基因和PBR322复制子之间的50bp序列，扩增bla基因5’端的22个碱基以下划线字母表示；R561 5’ -AGCAGATCCGTCGTGAACATC-3’，(SEQ ID NO. 7)，R561 为 R551 前端约 21 个碱基的序列；R562 :5’ -CTTTGATCTTTTCTACGGGGTC-3’，(SEQ ID NO. 8), R562 为 R552 前端约 21 个碱基的序列。R551和R552分别对应图I中的Pl和P2，R553和R554分别对应图I中的P3和P4,R561和R562分别对应图I中的P5和P6。以pLS2042为模板，R551和R552为引物，PCR扩增得到O. 5kb的DNA片段，R553和R554为引物，PCR扩增得到I. Okb的DNA片段。凝胶回收O. 5kb和I. Okb,合并作为模板，以R551和R554为引物，OE-PCR扩增得到I. 5kb的DNA片段，电转化至由上所得重组酶表达的电转化感受态细胞，在含50 μ g/ml的氨苄青霉素的抗性平板上筛选。设计引物 R566 :5’ -GTGTACAACATTCCAGCCCTG-3’，(SEQ ID NO. 9)，R566 位于靶位点GAA上游145bp处。随机挑选9个抗性克隆，培养，提取质粒后，以R566为测序引物进行测序，序列分析表明其中的4个克隆发生了定点突变，突变效率为45%。此时即获得了 E192N突变的克隆，将之命名为PLS2043。pLS2042和pLS2043的测序图见图2。可见在测序图谱中，PLS2042的E192所对应第121-124位的GAA突变为在pLS2043中第135-137位的AAC，AAC编码天冬酰胺(N)，表明实现了 E192 N突变，即定点突变完成。实施例3. nanA基因S208G的定点突变
设计 弓I 物 R555 :5’- cgaaatcttcgcctctggtctgctggcgggcgctgatggtggtatcggc gGTACCTACAACATCATGGGCTG-3’ , (SEQ ID NO. 10)，在此引物中，靶位点上游的 50bp 同源臂以小写字母表示，突变位点以斜体字母表示，扩增引物以下划线字母表示；R563 5’ -ACGAAATCTTCGCCTCTGGTC-3’，(SEQ ID NO. 11)，R563 为 R555 前端约 21 个碱基的序列。扩增nanA基因片段的引物R552、扩增bla的引物R553和R554、下游的扩增短引物R561和测序引物R566均于E192N设施例中的引物相同。R555和R552分别对应图I中的Pl和P2，R553和R554分别对应图I中的P3和P4，R56和R562分别对应图I中的P5和P6。以pLS2042为模板，R555和R552为引物，PCR扩增得到O. 5kb的DNA片段，R553和R554为引物，PCR扩增得到I. Okb的DNA片段。凝胶回收O. 5kb和I. Okb,合并作为模板，以R563和R554为引物，OE-PCR扩增得到I. 5kb的DNA片段，电转化至由上所得重组酶表达的电转化感受态细胞，在含50 μ g/ml的氨苄青霉素的抗性平板上筛选。随机挑选5个抗性克隆，培养，提取质粒后，以R566为测序引物进行测序，序列分析表明其中的5个克隆发生均了定点突变，突变效率为100%。此时即获得了 E192N突变的克隆，将之命名为PLS2044。pLS2042和pLS2044的测序图见图3。可见在测序图谱中，PLS2042的S208所对应第169位的A突变为在pLS2044中第179位的G，由此S208的密码子AGT突变为GGT (G)，表明实现了 S208G突变，即定点突变完成。
权利要求
1.一种基于重组工程的定点突变方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)通过重叠一延伸聚合酶链式反应获得一个DNA修饰片段，所述DNA修饰片段依次由下列结构组成与克隆在质粒上的待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、靶基因突变位点的下游片段、与质粒所含的抗性基因不同的另外一个抗性基因和载体所含的抗性基因下游的50bp右端同源臂； (2)将克隆靶基因的质粒转化基因染色体的重组工程菌株大肠埃希氏菌CGMCCNo.3192，大肠埃希氏菌CGMCC No. 3192含有受L-阿拉伯糖诱导表达的来源于从lambda噬菌体DNA的exo, bet和gam三个重组酶基因和来源于大肠杆菌的recA基因； (3)将步骤(I)得到的DNA修饰片段电转化至以终浓度为O.2%的L-阿拉伯糖诱导下表达Red重组酶基因的步骤(2)的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源臂和质粒上相同序列之间的同源重组，将所述DNA修饰片段中，左右50bp同源臂之间的片段取代质粒上两个同源臂之间的片段；直接获得靶位点发生定点突变，原质粒上的抗性基因被修饰片段做携带的抗性基因所取代的重组克隆。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于待突变位点和突变位点是一个或多个碱基。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，首先通过一个聚合酶链式反应得到含与克隆在质粒上的待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、靶基因突变位点的下游片段、与质粒所含的抗性基因不同的另外一个抗性基因和载体所含的抗性基因下游的50bp右端同源臂的融合DNA修饰片段。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，克隆有靶基因的质粒转化至基因染色体的重组工程菌株大肠埃希氏菌CGMCC No. 3192。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，同源臂用于通过重组酶催化的同源重组将含突变位点的DNA修饰片段取代质粒上两个同源臂之间的片段；靶位点发生突变，原质粒上的抗性基因被修饰片段做携带的抗性基因所取代，最终获得发生定点突变的重组克隆。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，重组酶基因是来自于lambda噬菌体的exo，bet和gam基因,来源于大肠杆菌的recA基因置于重组酶基因之下,重组酶基因和recA基因是克隆在受L-阿拉伯糖所诱导启动子之下，recA增加重组活性。
全文摘要
本发明涉及一种基于重组工程的定点突变的方法。本方法是先通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得一个含有与克隆在质粒上的待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、靶基因突变位点的下游片段、与质粒所含的抗性基因不同的另外一个抗性基因和载体所含的抗性基因下游的50bp右端同源臂的一个DNA修饰片段。随后将此融合片段电转化表达重组酶的、含有克隆有靶基因的质粒的大肠杆菌中，通过重组酶介导的同源重组，直接获得靶位点发生定点突变以及原质粒上的抗性基因被修饰片段做携带的抗性基因所取代的重组克隆。
文档编号C12N15/09GK102876623SQ201210378139
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者尚广东, 樊丹, 凌文, 石牡丹 申请人:南京师范大学