一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法
【专利摘要】本发明提供一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法，所述方法包括：（1）精液采集，（2）抗冻液选择，（3）精子的稀释与平衡，（4）精子的冷冻，（5）精子的解冻与复苏。本发明具有操作时间短、诱导效果好、毒性作用少、损伤程度小、成活率高等优点，其在大口黑鲈的种质保存、遗传育种、可持续养殖及病害防治等方面有着重要的理论意义和应用价值。本发明还提供一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法的用途。
【专利说明】一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及精子冷冻【技术领域】，具体涉及一种大口黑鲈精子的冷冻保存方法。
【背景技术】
[0002]我国是一个水产养殖大国，在常规养殖品种迅猛发展之后，特种水产品的养殖得到快速发展。大口黑鲈具有生长快、适应性强、病害少、容易捕捞等诸多优点，其肉味鲜美，营养丰富，颇受养殖者和消费者欢迎。自上世纪80年代引种以来，已经在广东、浙江和江苏形成了较大规模的产业。但是因引进时由野生种家养驯化而成，缺少定向选育，随着时间推移，大口黑鲈出现了不同程度的种质退化，主要表现在性成熟年龄提前、生长速度下降、抵抗疾病能力下降，开展大口黑鲈选育工作，选育生长速度快、品质优良的品系已势在必行。因此，对其进行精子冷冻保存技术的研究对于大口黑鲈种质资源的保护具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种能高效、长期保存大口黑鲈精子的超低温冷冻及复苏方法。
[0004]为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法，所述方法包括:(1)精液采集，(2)抗冻液选择，(3)精子的稀释与平衡，(4)精子的冷冻，(5)精子的解冻与复苏；
(1)精液采集:选择形态正常、生长良好、无疾病、达到性成熟的大口黑鲈个体，在大口黑鲈繁殖期按800UI/kg胸鳍注射进行诱导促熟，36h后收集精液于4°C冰箱中预冷的干净研钵中；
(2)抗冻液选择:以任氏液为基础，加10%甲醇抗冻保护剂；
(3)精子的稀释与平衡:精液与任氏液按1:6稀释后，经4°C平衡30min，加入10%甲醇，混匀，分装；
(4)精子的冷冻:分装好的精液在液氮面上方6cm处平衡IOmin,在液氮面上平衡5min后投入液氣中保存；
(5)精子的解冻与复苏:将冻存管在液氮蒸汽中平衡5分钟，迅速置于37°C水浴锅中快速晃动至融化。
[0005]本发明还提供一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法的用途，以所述大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法保存的精子用于进行人工授精:将大口黑鲈鱼卵挤入容器中，按IO5:1的精卵数量比例滴加入解冻后的精液，拌匀，再滴加适量激活液(10 mMTrfs, 20 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH=8.5)，拌匀，使卵受精。
[0006]优选的，所述激活液由10 mM Trfs,20 mM NaCl和2 mM CaCl2配成，配好后的激活液 pH=8.5。
[0007]本发明具有操作时间短、诱导效果好、毒性作用少、损伤程度小、授精率高等优点，其在大口黑鲈的种质保存、遗传育种、可持续养殖及病害防治等方面有着重要的理论意义和应用价值。
【具体实施方式】
[0008]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。
[0009]实施例1，
亲鱼的选择:形态正常、生长良好、无疾病、达到性成熟的原种或良种。
[0010]精子的采集:在大口黑鲈繁殖期按800UI/kg腹腔注射进行诱导增精，36h后，收集精液于4°C冰箱中预冷的干净研钵中。
[0011]鲜精活力检测:先用细口吸管吸一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下边搅匀边观察其活力。
[0012]冷冻方法:将精液与任氏液按1:6稀释后，经4°C平衡30min，加入10%甲醇混匀，分装，在液氮面上方6cm处平衡lOmin，在液氮面上平衡5min后投入液氮中保存。
[0013]解冻方法:将冻存管在液氮蒸汽中平衡5分钟，迅速置于37°C水浴锅中快速晃动至融化。
[0014]冻精活力检测:先用细口吸管吸一滴激活液于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下边搅匀边观察其活力。
[0015]本发明具有操作时间短、诱导效果好、毒性作用少、损伤程度小、成活率高等优点。其在大口黑鲈的种质保存、遗传育种、可持续养殖及病害防治等方面有着重要的理论意义和应用价值。
[0016]以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
【权利要求】
1.一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法，其特征在于，所述方法包括:(1)精液采集，(2)抗冻液选择，(3)精子的稀释与平衡，(4)精子的冷冻，(5)精子的解冻与复苏； 精液采集:选择形态正常、生长良好、无疾病、达到性成熟的大口黑鲈个体，在大口黑鲈繁殖期按800UI/kg胸鳍注射进行诱导促熟，36h后收集精液于4°C冰箱中预冷的干净研钵中； 抗冻液选择:以任氏液为基础，加10%甲醇抗冻保护剂； 精子的稀释与平衡:精液与任氏液按1:6稀释后，经4°C平衡30min，加入10%甲醇，混匀，分装； 精子的冷冻:分装好的精液在液氮面上方6cm处平衡IOmin,在液氮面上平衡5min后投入液氣中保存； 精子的解冻与复苏:将冻存管在液氮蒸汽中平衡5分钟，迅速置于37°C水浴锅中快速晃动至融化。
2.一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法的用途，其特征在于，以所述大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法保存的精子用于进行人工授精:将大口黑鲈鱼卵挤入容器中，按105:1的精卵数量比例滴加入解冻后的精液，拌匀，再滴加适量激活液，拌匀，使卵受精。
3.如权利要求2所述的大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法的用途，其特征在于，所述激活液由10 mM Trfs,20 mM NaCl和2 mM CaCl2配成，配好后的激活液pH=8.5。
【文档编号】C12N5/076GK103719071SQ201210382548
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月11日 优先权日:2012年10月11日
【发明者】徐海华, 王荣泉, 宣云峰 申请人:吴江市长漾渔业生态科技发展有限公司