专利名称：利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域中花生四烯酸的制备方法，特别指经液体培养后的高山被孢霉菌体，粉粹后接种至固料培养基，培养繁殖大量孢子，再经液体发酵制备花生四烯酸的方法。
背景技术：
花生四烯酸(ARA)是人体前列腺素合成的重要前体物质，具有酯化胆固醇、抑制血小板聚集、增加血管弹性、降低血液黏度、调节白细胞功能、提高免疫力等一系列生理活性。过去商业ARA主要来源于猪肝和鱼油，但含量极低且不稳定，开发费用昂贵，难以满足社会的需求，特别是奶制品和制药行业所需的ARA量很大。八十年代初期，人们相继发现某些丝状真菌及微藻类含有花生四烯酸。由于微生物具有生长速度快、油脂及ARA含量高、发酵制备工艺比较简单且不受原料限制等优点，利用微生物法生产花生四烯酸成为各国研究的热点。高山被孢霉(Mortierella alpina)被认为是最佳的ARA生产菌株,它具有ARA含量高且PUFAs组成合理等特点。目前，利用alpina发酵生产AM的研究主要集中在菌种选育、培养基优化等方面。研究一种从菌体培养出发，结合发酵过程定向调控，有效提高发酵水平的花生四烯酸制备方法是有市场前景的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法，这种方法是高山被孢霉的种子培养方法，并结合适当的发酵工艺，以缩短其发酵周期，提高其产量质量。本方法所使用的菌种为产花生四烯酸的普通高山被孢霉。本发明制备孢子所采用的方法为菌体经液体培养后，收集菌体并粉碎，再接种至固料培养基。经液体培养后的成熟菌体，接种至固料培养基后能大量产生孢子。 本发明所用的产孢子培养基为固料培养基。该培养基的特征在于，以米糠、玉米粒为原料，添加适量的无机盐配制而成。本发明在发酵培养调控过程中，所添加物质为柠檬酸三钠及一水柠檬酸。柠檬酸三钠呈碱性，柠檬酸呈酸性，在菌体大量繁殖生长阶段，使pH值稳定在6. O 6. 5之间，有利于ARA菌体细胞的生长繁殖。而在ARA发酵产油阶段添加，能对pH值进行调节，使pH值稳定在7. 5 8. O之间，有利于提高乙酰辅酶A羧化酶活性。乙酰辅酶A羧化酶催化的反应是脂肪酸合成过程中的限速步骤，是脂肪酸合成调控的关键所在。同时柠檬酸被菌体吸收，在细胞溶胶中，受柠檬酸裂解酶作用而断裂，生成乙酰辅酶A。而乙酰辅酶A是脂肪酸合成的关键起始物质。本发明要解决的技术问题由如下方案来实现将在PDA培养基上长好的菌种用20mL无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装量为50mL的液体摇瓶培养基中，于28°C，180rpm恒温摇床培养2天，在液体摇瓶中培养好的菌体通过过滤收集菌体，经无菌水洗涤，用电磨机粉碎成长度在1000 2000 μ m，再接种至灭菌好的固料培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，并摊匀物料，于28°C培养3 5天，培养期间，每24h时补水2mL以维持适当的相对湿度，并搅拌翻料，将400mL无菌生理盐水倒入培养好的固料种子的克氏瓶中，充分振荡，以洗下孢子，孢子液按I. 2%的接种量接入30L种子罐中进行放大培养，二级种子液再以10%的接种量接入100L发酵罐进行发酵生产花生四烯酸，所述液体摇瓶培养基葡萄糖20 60g/L，酵母粉5 20g/L，硫酸镁O. I lg/L，磷酸二氢钾O. I 2g/L ;所述固料培养基以米糠、玉米碎粒为原料，与浓度为I 3g/L磷酸氢二钾按10 : I 5的质量比混勻,在不锈钢锅内蒸煮30min后,摊开晾开表面水分,分装于IOOOmL克氏瓶中，每瓶装量为200g，于121°C灭菌30min。具体步骤如下I、利用液体培养基培养高山被孢霉菌体 ①液体摇瓶培养基葡萄糖20 60g/L，酵母粉5 20g/L，硫酸镁O. I lg/L，磷酸二氢钾O. I 2g/L。培养基经121°C灭菌30min。②将在PDA培养基上长好的菌种用20mL无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至上述灭菌好的装量为50mL的液体摇瓶培养基中，于28°C，180rpm恒温摇床培养2天。2、收集上述培养好的菌体，粉粹后接种至固料培养基中①以米糠、玉米碎粒为原料，与浓度为I 3g/L磷酸氢二钾按10 : I 5的质量比混匀，在不锈钢锅内蒸煮30min后，摊开晾开表面水分，分装于IOOOmL克氏瓶中，每瓶装量为200g，于121°C灭菌30min制成固料培养基。②将在液体摇瓶培养好的菌体通过过滤收集菌体，经无菌水洗涤，用电磨机粉碎成长度在1000 2000 μ m,再接种至上述灭菌好的固料培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，并摊匀物料，于28°C培养3 5天。培养期间，每24h时补水2mL以维持适当的相对湿度,并搅拌翻料。3、上述利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的以碳源为主的固体物料为米糠、玉米碎粒，米糠、玉米碎粒的质量比为10 : I 5。4、发酵制备花生四烯酸将400mL无菌生理盐水倒入培养好的固料种子的克氏瓶中，充分振荡，以洗下孢子。孢子液按I. 2%的接种量接入30L种子罐中进行放大培养，二级种子液再以10%的接种量接入100L发酵罐进行发酵生产花生四烯酸。5、发酵过程pH值进行分段控制，其特征在于，前48h使pH值稳定在6. O 6. 5之间，而后使pH值稳定在7. O 9. O之间。6、发酵过程中使用于调节pH值的物质为柠檬酸及柠檬酸盐本发明的有益效果I、本发明所采用的孢子培养方法有利于孢子的大量产生；2、本发明所采用的固料培养基疏松度良好，生产的孢子易于与培养基和菌丝体分离，为发酵生产所提供的种子液中孢子量大，同步性佳，能够缩短整个发酵周期；3、本发明提供的种子，在发酵上具有更高的活力，能够提高产物的产量与质量；4、本发明使用柠檬酸三钠及一水柠檬酸进行发酵调控有利于脂肪酸的合成，能够提高脂肪酸合成速度及合成量，从而提高ARA发酵水平。
图I为本发明的发酵工艺流程图。
具体实施例方式I、液体种子与固料种子的小试发酵结果对比①液体种子小试发酵流程PDA斜面种子一液体摇瓶培养一30L种子罐(二级种子)一100L发酵罐。PDA斜面制作，是本行业人士所熟悉的。液体摇瓶培养基葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，硫酸镁O. 5g/L，磷酸二氢钾I. Og/L0二级种子培养基葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，硫酸镁O. 5g/L，磷酸二氢钾I. Og/L0发酵培养基葡萄糖30g/L，酵母粉15g/L，硫酸铵O. 5g/L，硫酸镁O. 5g/L，硫酸锌O. 01g/L，磷酸二氢钾I. Og/L，谷氨酸钠O. 8g/L。具体流程用20mL无菌生理盐水洗下PDA斜面孢子，接入灭菌好的装有400mL种子培养基的摇瓶中，于恒温摇床28°C，180rpm培养3天；培养好的摇瓶种子按I. 2%的接种量接入30L种子罐中，接种后培养液体积15L，28°C，pH值6. O 6. 5，转速lOOrpm，罐压0. 03Mpa，通气量I. OmVh培养2天；将二级种子液按10%接种量接入100L发酵罐中，接种后培养液体积60L, 28°C，pH值6. O 6. 5，转速60rpm,罐压0. 03MPa，通气量2. O 3. Om3/h，发酵培养8天。发酵72h后，每24h取样检测单位培养液中总油脂重量，及ARA纯度。②固料种子小试发酵流程PDA斜面种子一液体摇瓶培养一固料种子培养一30L种子罐(二级种子)—100L发酵罐。固料培养基以米糠、玉米碎粒为原料，米糠、玉米碎粒的质量比为3 1，与浓度为2g/L磷酸氢二钾溶液按5 I的质量比混匀，在不锈钢锅内蒸煮30min后，摊开晾开表面水分，分装于IOOOmL克氏瓶中，每瓶装量为200g，于121°C灭菌30min。PDA培养基、液体摇瓶培养基、二级种子培养基及发酵培养基如前所述。具体流程将在PDA培养基上长好的菌种用20mL无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至上述灭菌好的装量为50mL的液体摇瓶培养基中，于28°C，180rpm恒温摇床培养2天。在液体摇瓶培养好的菌体通过无菌纱布过滤收集菌体，经无菌水洗涤2次，用电磨机粉碎成长度在1400 1600 μ m，再接种至上述灭菌好的固料培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，并摊匀物料，于28°C培养3天。培养期间，每24h时补水2mL以维持适当的相对湿度，并搅拌翻料。将400mL无菌生理盐水倒入培养好的固料种子的克氏瓶中，充分振荡，以洗下孢子。将孢子液按I. 2%的接种量接入30L种子罐中，接种后培养液体积15L，28°C，pH值6. O 6. 5，转速lOOrpm，罐压0. 03MPa,通气量I. 0m3/h培养2天；将二级种子液按10%接种量接入100L发酵罐中，接种后培养液体积60L，28°C，pH值6. O 6. 5，转速60rpm，罐压0. 03MPa，通气量2. O 3. 0m3/h。发酵培养8天。发酵72h后，每24h取样检测单位培养液中总油脂重量，及ARA纯度。两组实验方案在发酵过程中均采用流加液糖、磷酸二氢钾，以控制糖及磷的浓度分别在35 45g/L、0. 08 0. 12g/L。空气流量72h前为2. 0m3/h, 72h后调为3. 0m3/ho实验结果如表I。表I液体种子与固料种子小试发酵结果
权利要求
1.利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法，其特征在于将在PDA培养基上长好的菌种用20mL无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装量为50mL的液体摇瓶培养基中，于28°C，180rpm恒温摇床培养2天，在液体摇瓶中培养好的菌体通过过滤收集菌体，经无菌水洗涤，用电磨机粉碎成长度在1000 2000 μ m,再接种至灭菌好的固料培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，并摊匀物料，于28°C培养3 5天，培养期间，每24h时补水2mL以维持适当的相对湿度，并搅拌翻料，将400mL无菌生理盐水倒入培养好的固料种子的克氏瓶中，充分振荡，以洗下孢子，孢子液按I. 2%的接种量接入30L种子罐中进行放大培养，二级种子液再以10%的接种量接入100L发酵罐进行发酵生产花生四烯酸，所述液体摇瓶培养基葡萄糖20 60g/L,酵母粉5 20g/L,硫酸镁O. I Ig/L，磷酸二氢钾O. I 2g/L ;所述固料培养基以米糠、玉米碎粒为原料，与浓度为I 3g/L磷酸氢二钾按10 :1 5的质量比混匀，在不锈钢锅内蒸煮30min后，摊开晾开表面水分，分装于IOOOmL克氏瓶中，每瓶装量为200g，于121°C灭菌30min。
2.按权利要求I所述的利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的固体培养基所用物料为米糠、玉米碎粒，米糠、玉米碎粒的质量比为10 : I 5。
3.按权利要求I所述的利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述发酵过程PH值进行分段控制，前48h使pH值稳定在6. O 6. 5之间，而后使pH值稳定在7. O 9. O之间。
4.按权利要求3所述的利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述发酵过程进行PH值分段控制使用于调节pH值的物质为柠檬酸及柠檬酸盐。
全文摘要
本发明公开了一种利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法，以米糠、玉米粒为物料，适量添加无机盐作为固料培养基，菌种经液体培养后，收集菌体并粉碎，接种至固料培养基中，控制培养温度，在培养过程中补水控制相对湿度并适当搅拌，使其产生大量的孢子。发酵过程使用柠檬酸及柠檬酸盐进行pH值分段调控。本方法所提供的种子孢子量大，同步性佳，活力强，可以缩短高山被孢霉的发酵周期，并通过pH值分段调控促进高山被孢霉的生长与ARA油脂积累，能够提高ARA的产量和质量。
文档编号C12P7/64GK102925503SQ201210385420
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者蔡金柱, 徐鲁明, 陈必钦, 朱友跑, 赖荣乾, 戴昌华, 吴轶, 詹光煌 申请人:内蒙古金达威药业有限公司, 厦门金达威集团股份有限公司