专利名称：发酵－酶解－提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法
技术领域：
本发明涉及生化物质转化提取技术领域，具体涉及一种发酵一酶解一提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法。
背景技术：
柑橘是世界第一大水果，我国柑橘种植面积和产量均位居世界第一。橙皮苷是柑橘中的主要黄酮，由于橙皮苷的水溶性和吸收性较差，表现出的药理作用相对较弱。通过化学法或酶法将橙皮苷脱去一分子的鼠李糖苷，生成橙皮素单葡萄糖苷可提高其水溶性，有效增强其功效，目前橙皮素单葡萄糖苷市场价格高达1000元/kg以上。但化学法的水解反应条件难以掌握。目前有报道通过橙皮苷酶降解橙皮苷生成橙皮素单葡萄糖苷，橙皮苷酶是由α-鼠李糖苷酶和β_葡萄糖苷酶组成的复合酶，但该复合酶不仅能将橙皮苷转化为橙皮素单葡萄糖苷，而且又能进一步将橙皮素单葡萄糖苷降解为橙皮素，而橙皮素的水溶性比橙皮素单葡萄糖苷低，故其生物活性的有效利用率也明显降低。因此，该直接酶解方法不仅存在有橙皮素单葡萄糖苷得率较低，同时，该橙皮苷酶目前的价格较昂贵，还无法用于工业化生产。
发明内容
本发明目的是，针对现有利用橙皮苷酶酶解橙皮苷制备橙皮素单葡萄糖苷方法存在有得率低、易被降解，且橙皮苷酶价格较高等的问题，提出一种得率高，且既能降低生产成本，又能防止生成的橙皮素单葡萄糖苷进一步降解为橙皮素的发酵一酶解一提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法。一种用于橙皮苷发酵，高效提取、制备橙皮素单葡萄糖苷菌株的选育，鉴定及其生物学特性与保藏
(I)菌种的初筛
菌种于2011年7月取样于浙江省衢州市橙皮苷生产工厂的柑橘幼果原料中。称取原料样品2. O g加入20 ml无菌生理盐水中，振荡10 min后静置分层，取上层悬液10倍比稀释，将梯度稀释为10—1、Γ2、10' 10_4、10_5、IO-6的菌液涂布于分离培养基上于30 °C培养4 d后，从该分离培养基上挑取单菌落，再接种于橙皮苷筛选培养基上，于30°C培养4 d后依据透明圈的大小，从中筛选获得14株菌株；将所得的菌株分别保存在保存培养基试管斜面上，培养72小时后,将菌种分别保存于4 °C冰箱中，并每3周活化一次；其中的，
分离培养基为葡萄糖 30 g，牛肉膏 I g，K2HPO4 · 3H20 I g，MgSO4 · 7H20 0.5 g，FeSO4 · 7H20 0. 01 g，蒸馏水 1000 mL，pH 自然;
橙皮苷筛选培养基为:牛肉膏 I g，K2HPO4 · 3H20 I g, MgSO4 · 7H20 0. 5 g, FeSO4 · 7H20
0.01 g，蒸馏水1000 mL，橙皮苷I g，琼脂15 g，pH自然;
保存培养基为葡萄糖 30 g，牛肉膏 I g，K2HPO4 · 3H20 I g，MgSO4 · 7H20 0.5 g，FeSO4 · 7H20 O. 01 g，蒸馏水 1000 mL，琼脂 15 g，pH 自然;
(2)菌种的复筛
将上述的保存菌种挑取少量，分别接种于发酵培养基中，在30 0C >160 rpm旋转摇床上培养4天，分别取发酵液，测定液中还原糖和橙皮素单葡萄糖苷的含量；检测结果表明，菌株HESPER能够产生橙皮素单葡萄糖苷酶，并能产生橙皮素单葡萄糖苷，且传代稳定性好；其中，
发酵培养基为牛肉膏 I g，K2HPO4 · 3H20 I g, MgSO4 · 7H20 O. 5 g, FeSO4 · 7H20 0. 01g，蒸馏水1000 mL，橙皮苷I g，pH自然；
(3)菌株HESPER生物学特征鉴定
形态学特征在25 °C左右培养箱中培养4 d，该菌株不产生小分生孢子，其大分生孢子小，10 25 μ mX 2. 5 3.0 μ m，腊肠形，弯曲；在25 °C左右最适生长和产孢，气生菌丝毡状，中度丰茂，白色到淡桔黄色，培养基底面无色到淡桔黄色；
基因序列分析研究结果表明，菌株HESPER的18S rDNA序列与nivale的18S rDNA序列同源性达到99% ；
鉴定结果将菌株HESPER的菌落与形态学特征对照伯杰氏细菌鉴定学手册，结合该菌株能够发酵产生大量细菌纤维素的性质，根据其18S rDNA序列分析结果，确定菌株HESPER为肉座菌目雪腐镰孢iFusarium ni vale ),将其命名为肉座菌目雪腐镰孢um ni valeHESPER。肉座菌目雪腐镰孢Fusarium nivale,于2012年6月19日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 6238。本发明目的通过以下技术方案来实现。发酵一酶解一提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法，该方法按以下步骤进行O培养液的配制包括以下两种培养液的组分与各组分的质量百分比含量为
a、菌种活化培养液葡萄糖3%，牛肉膏 O. 3%，K2HPO4 · 3H20 O. 3%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,FeSO4 · 7H20 O. 01%,以水补足至 100%，备用；
b、生产发酵培养液蔗糖3%，牛肉膏 O. 3%，K2HPO4 · 3H20 O. 3%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,FeSO4 · 7H20 O. 01%,以水补足至 100%，备用；
2)菌种种子液的制备以肉座菌目雪腐镰孢iFusarium ni vale ) HESPER菌株CGMCCNo. 6238为菌种，挑取少量菌种于菌种活化培养液中，在30 °C >150 180 r/min条件下活化培养24 48 h，至培养液中菌数密度会100 mg细胞干重/100 ml时，作为菌种种子液，备用;
3)橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液的配制将步骤2)的菌种种子液和步骤I)的生产发酵培养液及橙皮苷按体积重量I 2 mL 50 100 mL O. 5 I g比例混合、拌匀成橙皮苷生产发酵液后，先将其中的300L装入500L的发酵罐(3)中，其余的贮藏于补料罐(6)内，备用；
4)橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液的培养发酵罐(3)培养温度30°C，通过鼓泡装置
(2)将过滤后的无菌空气按I 5 L/分钟输入发酵液内，同时用搅拌器(I)按20 80转/分钟进行搅拌，发酵培养至菌数密度3 60mg细胞干重/100 ml ；5)发酵液的树脂吸附、回流、排料与补料将发酵罐(3)中的发酵液用蠕动泵B(7)经100目滤网(4)过滤后输入大孔树脂柱(8)内，经吸附后的发酵液按I 4倍柱体积/小时的回流速度返回到发酵罐(3)中，按此循环流动直至大孔树脂(8)吸附饱和；将该大孔树脂柱(8)从耦联装置中移出，另装入新的大孔树脂柱(8)后再进行吸附；在上述循环过程中，按每隔15 30小时通过排料口(9)排出发酵罐(3)内10 30 %物料的同时，通过蠕动泵A (5)将贮藏于补料罐(6)内的橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液泵入发酵罐(3)内进行补料；
6)树脂的洗脱与收集将吸附饱和的大孔树脂柱(8)用2 8倍柱体积/小时清水洗涤后，再用70 100 %的乙醇按O. 5 2倍柱体积/小时流速进行洗脱；将洗脱液经旋转蒸发器浓缩干燥、烘干、粉碎后即成橙皮素单葡萄糖苷产品。所述的大孔树脂柱为HPD100、AB-8或DlOl-I中的任选一种。本发明的有益效果是
1、本发明采用发酵一酶解一提取耦联的方法，利用橙皮素单葡萄糖苷水溶性优于橙皮素和橙皮苷的特点，将反应的中间产物提取出来，制成橙皮素单葡萄糖苷的产品；
2、本发明以连续培养代替分批培养，通过滤网过滤进行菌体循环利用，且与树脂吸附橙皮素单葡萄糖苷相耦合，分离出产物橙皮素单葡萄糖苷后的发酵液返回发酵罐循环利用，有效防止生成的橙皮素单葡萄糖苷进一步降解为橙皮素，为橙皮素单葡萄糖苷工业化生产降低原料损耗，提高产品得率；与现有利用橙皮苷酶酶解橙皮苷制备橙皮素单葡萄糖苷方法相比，该工艺的橙皮素单葡萄糖苷转化率提高了 4倍以上，且生产成本降低了 50%以上。
图I发酵一酶解一提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的工艺流程示意图其中，I、搅拌器；2、鼓泡装置；3、发酵罐；4、滤网；5、蠕动泵A ；
6、补料罐；7、蠕动泵B ;8、大孔树脂柱；9、排料口
具体实施例方式通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于以下内容。对实施例中所涉设备、材料的说明
鼓泡装置实验室自制；
大孔树脂HPD100:沧州宝恩吸附材料科技有限公司；
大孔树脂AB-8:沧州宝恩吸附材料科技有限公司；
大孔树脂DlOl-I:沧州宝恩吸附材料科技有限公司；
橙皮苷纯度98%，衢州天圣植物提制有限公司；
滤网100目，尼龙，台州市百斯特网业有限公司；
实施例I :
发酵一酶解一提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法，该方法按以下步骤进行
O培养液的配制包括以下两种培养液的组分与各组分的质量百分比含量为a、菌种活化培养液葡萄糖3%，牛肉膏 O. 3%，K2HPO4 · 3H20 O. 3%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,FeSO4 · 7H20 O. 01%,以水补足至 100%，备用；
b、生产发酵培养液蔗糖3%，牛肉膏 O. 3%，K2HPO4 · 3H20 O. 3%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,FeSO4 · 7H20 O. 01%,以水补足至 100%，备用；
2)菌种种子液的制备以肉座菌目雪腐镰孢iFusarium ni vale ) HESPER菌株CGMCCNo. 6238为菌种，挑取少量菌种于菌种活化培养液中，在30 °C ,150 r/min条件下活化培养48 h，至培养液中菌数密度3 100 mg细胞干重/100 ml时，作为菌种种子液，备用；
3)橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液的配制将步骤2)的菌种种子液和步骤I)的生产发酵培养液及橙皮苷按体积重量=ImL 50 mL O. 5 g比例混合、拌匀成橙皮苷生产发酵液后，先将其中的300L装入500L的发酵罐(3)中，其余的贮藏于补料罐(6)内，备用；
4)橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液的培养发酵罐(3)培养温度30°C，通过鼓泡装置
(2)将过滤后的无菌空气按I L/分钟输入发酵液内，同时用搅拌器(I)按20转/分钟进行搅拌，发酵培养至菌数密度3 60mg细胞干重/100 ml ；
5)发酵液的树脂吸附、回流、排料与补料将发酵罐(3)中的发酵液用蠕动泵B(7)经100目滤网(4)过滤后输入大孔树脂柱HPD100 (8)内，经吸附后的发酵液按I柱体积/小时的回流速度返回到发酵罐(3)中，按此循环流动直至大孔树脂HPD100 (8)吸附饱和；将大孔树脂柱HPD100 (8)从耦联装置中移出，另装入新的大孔树脂柱HPD100 (8)后再进行吸附；在上述循环过程中，按每隔15小时通过排料口(9)排出发酵罐内10%物料的同时，通过蠕动泵A (5)将贮藏于补料罐(6)内的橙皮苷生产发酵液泵入发酵罐(3)内进行补料10% ；
6)树脂的洗脱与收集将吸附饱和的大孔树脂柱(8)用2倍柱体积/小时清水洗涤后，再用70%的乙醇按O. 5倍柱体积/小时流速进行洗脱；将洗脱液经旋转蒸发器浓缩干燥、烘干、粉碎后即成橙皮素单葡萄糖苷产品。经该工艺生产橙皮素单葡萄糖苷橙皮苷的转化率可达到43%，比通常采用酶解方法得到橙皮素单葡萄糖苷转化率提高4. 2倍。实施例2:
本例中，步骤2)菌种种子液的制备培养转速为170 r/min，活化时间为36 h ;步骤
3)橙皮苷生产发酵液的配制菌种种子液生产发酵培养液橙皮苷=I. 5mL 75mL O. 75g ;步骤4)橙皮苷生产发酵液的培养无菌空气输入速率为2. 5 L/min，搅拌速度为50r/min ;步骤5)发酵液的树脂吸附、回流、排料与补料大孔树脂采用AB-8型号，发酵液回流速度为2柱体积/h，物料排放间隔时间为20 h，物料排出量为20%，同时补料20% ;步骤6)树脂的洗脱与收集清水洗涤量为5柱体积/h，乙醇浓度为85%，乙醇洗脱速率为I柱体积/h ;其余步骤、工艺同于实施例I。实施例3:
本例中，步骤2)菌种种子液的制备培养转速为180 r/min，活化时间为24 h;步骤3)橙皮苷生产发酵液的配制菌种种子液生产发酵培养液橙皮苷=2mL IOOmL Ig ；步骤4)橙皮苷生产发酵液的培养无菌空气输入速率为5 L/min，搅拌速度为80 r/min ;步骤5)发酵液的树脂吸附、回流、排料与补料大孔树脂采用DlOl-I型号，发酵液回流速度为4柱体积/h，物料排放间隔时间为30 h，物料排出量为30%，同时补料30% ;步骤6 )树脂的洗脱与收集清水洗涤量为8柱体积/h，乙醇浓度为100%，乙醇洗脱速率为2柱体积/h ;其余步骤、工艺同于实施例I。
权利要求
1.肉座菌目雪腐镰刀菌iFusariumni vale ) HESPER菌株，其菌株保藏号为CGMCCNo.6238。
2.发酵一酶解一提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法，其特征在于按以下步骤进行 1)培养液的配制包括以下两种培养液的组分与各组分的质量百分比含量为 a、菌种活化培养液葡萄糖3%，牛肉膏 O. 3%，K2HPO4 · 3H20 O. 3%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,FeSO4 · 7H20 O. 01%,以水补足至 100%，备用； b、生产发酵培养液蔗糖3%，牛肉膏 O. 3%，K2HPO4 · 3H20 O. 3%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,FeSO4 · 7H20 O. 01%,以水补足至 100%，备用； 2)菌种种子液的制备以肉座菌目雪腐镰刀菌/ i>a7e)HESPER菌株CGMCCNo. 6238为菌种，挑取少量菌种于菌种活化培养液中，在30 °C >150 180 r/min条件下活化培养24 48 h，至培养液中菌数密度会100 mg细胞干重/100 ml时，作为菌种种子液，备用; 3)橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液的配制将步骤2)的菌种种子液和步骤I)的生产发酵培养液及橙皮苷按体积重量I 2 mL 50 100 mL O. 5 I g比例混合、拌匀成橙皮苷生产发酵液后，先将其中的300L装入500L的发酵罐(3)中，其余的贮藏于补料罐(6)内，备用； 4)橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液的培养发酵罐(3)培养温度30°C，通过鼓泡装置(2)将过滤后的无菌空气按I 5 L/分钟输入发酵液内，同时用搅拌器(I)按20 80转/分钟进行搅拌，发酵培养至菌数密度3 60mg细胞干重/100 ml ； 5)发酵液的树脂吸附、回流、排料与补料将发酵罐(3)中的发酵液用蠕动泵B(7)经100目滤网(4)过滤后输入大孔树脂柱(8)内，经吸附后的发酵液按I 4倍柱体积/小时的回流速度返回到发酵罐(3)中，按此循环流动直至大孔树脂(8)吸附饱和；将该大孔树脂柱(8)从耦联装置中移出，另装入新的大孔树脂柱(8)后再进行吸附；在上述循环过程中，按每隔15 30小时通过排料口(9)排出发酵罐(3)内10 30 %物料的同时，通过蠕动泵A (5)将贮藏于补料罐(6)内的橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液泵入发酵罐(3)内进行补料； 6)树脂的洗脱与收集将吸附饱和的大孔树脂柱(8)用2 8倍柱体积/小时清水洗涤后，再用70 100 %的乙醇按O. 5 2倍柱体积/小时流速进行洗脱；将洗脱液经旋转蒸发器浓缩干燥、烘干、粉碎后即成橙皮素单葡萄糖苷产品。
3.按权利要求I所述的方法，其特征在于所述的大孔树脂柱为HPD100、AB-8或DlOl-I中的任选一种。
全文摘要
本发明公开了发酵－酶解－提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法，属于生化物质提取技术领域。方法包括培养液的配制；菌种种子液的制备；橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液的配制；橙皮素单葡萄糖苷生产发酵液的培养；发酵液的树脂吸附、回流、排料与补料；树脂的洗脱与收集等步骤。本发明以肉座菌目雪腐镰刀菌(Fusariumnivale)HESPER菌株CGMCCNo.6238为菌种，将连续培养发酵、酶解橙皮苷、提取相耦合制备成橙皮素单葡萄糖苷，有效防止产品进一步降解为橙皮素，提高了产率，降低了生产成本。本发明可在有关地区、企业推广应用。
文档编号C12N1/14GK102925364SQ20121038697
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者张俊, 夏其乐, 陈剑兵, 邢建荣, 陆胜民, 李小莉 申请人:浙江省农业科学院