抗骨桥蛋白抗体的制作方法

专利名称：抗骨桥蛋白抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体，尤其涉及一种抗骨桥蛋白抗体。
背景技术：
骨桥蛋白(osteopontin，0ΡΝ)是一种分泌型磷酸化糖蛋白，在多种腔上皮，如消化道黏膜中有少量表达，可参与细胞的信号转导，促进细胞黏附和迁移。Senger等于1979年首次在恶性转化的上皮细胞株中发现，称之为转化相关性磷酸蛋白。1986年，Franzen等从骨组织中分离出一种磷蛋白，其特性与Senger等发现的磷蛋白相似，正式将其命名为骨桥蛋白。
骨桥蛋白也是一种非常重要的致炎症细胞因子，由巨噬细胞、树突状细胞、角质化细胞与上皮细胞产生。它属于4-α-螺旋束细胞因子家族。骨桥蛋白能够活化多种免疫细胞、刺激它们增殖并延长其寿命。近年来对骨桥蛋白与肿瘤的关系的研究发现，骨桥蛋白的过度表达与人类多种肿瘤，如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、食管癌、肝癌等肿瘤细胞生长、增殖和侵袭、转移密切相关。卵巢癌是妇科常见三大恶性肿瘤之一，其病死率位列妇科三大恶性肿瘤之首。因早期时缺乏典型症状，无创检查不易发现其早期病变，故多数病例发现时已属晚期。卵巢癌III期及IV期患者的5年生存率不到20%，而I期患者的5年生存率可90%。临床上普遍采用的糖类抗原CA125。然而，仅50%左右早期至I期和II期的卵巢癌病患血清中能检测到 CA125 的高表达(Coticchia 等，“Ovarian cancer biomarkers Current options andfuture promise. ”《J Natl Compr Cancer Network)) 2008 年第 6 卷 8 期)。骨桥蛋白不仅在卵巢癌及卵巢交界性恶性肿瘤组织中的表达高于在良性肿瘤和正常卵巢上皮组织，而且晚期卵巢癌组织中的表达也明显高于早期癌，在有癌转移的淋巴结中同样高表达。OPN的血清学检查不仅可以用于区别健康人群和卵巢癌患者，还可用于区分卵巢癌和卵巢良性肿瘤。OPN与其他肿瘤标志物联合检测时可以提高卵巢癌的检出率(Dutta 等，“Biomarkers for ovarian cancer detection and therapy·，，((Cancer Biol&Therapy)) 2010 年第 9 卷 9 期)。马哲和张虹(“骨桥蛋白在卵巢癌组织中的表达及意义。”《现代诊断与治疗》2011年第22卷3期)采用免疫组化法检测35例上皮性卵巢癌组织、17例交界性卵巢肿瘤、15例卵巢良性肿瘤组织及6例正常卵巢组织标本中OPN的表达，分析其与临床病理特征的关系及相关性。结果发现OPN在上皮性卵巢癌、交界性卵巢肿瘤、卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中阳性表达率分别为69%、65%、26%及0%。因此，OPN在卵巢癌组织中显著高表达；其表达和术前血CA125水平相关，足卵巢癌早期诊断、病情监测及评价预后的生物标志物之一。骨桥蛋白在肺癌病患血清中也有高表达，血清OPN检测在肺癌患者临床诊疗中同样有应用价值。董淑敏等(“肺癌患者外周血骨桥蛋白检测的临床意义”《现代中西医结合杂志》2008年24期)选择不同临床 Μ分期的肺癌患者120例作为肺癌组，同期肺炎性假瘤患者23例作为疾病对照组，49例门诊体检正常者作为健康对照组，应用酶联免疫吸附法(ELISA)进行血清骨桥蛋白水平检测。同时对其中67例临床治疗有效的肺癌患者行治疗前后(放化疗或手术前后)该肿瘤标志物血清水平比较。结果血清骨桥蛋白水平在I II期患者中为(73. 7±32. 9) μ g/L，在III期患者中为(144. 6±44. 7) yg/L，在IV期患者中则可达(395. 8±105. 2) μ g/L。说明骨桥蛋白血清水平是一个较好的评价肺癌进展程度的血清学指标，且有助于临床对肺癌临床疗效的评判。

发明内容
本发明提供了一种特异性高的抗骨桥蛋白抗体。一种抗骨桥蛋白抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的三个高变区 CDRHl、CDRH2、CDRH3 的氨基酸序列分别为GGSFSGYYW、IYYSGSTYYNPSLKS、HDYYDFWSGYYDAFDI，所述轻链可变区的三个高变区⑶RL1、⑶RL2、⑶RL3的氨基酸序列分别为TGSSSDVGDYYYVS、DVNYRPS、SSYRDTQILG。所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。 所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述抗骨桥蛋白抗体可以是全抗体、抗体片段或单链抗体。本发明还提供了编码所述抗骨桥蛋白抗体的基因。本发明还提供了所述抗骨桥蛋白抗体在在检测卵巢癌细胞和肺癌细胞中的应用。本发明抗骨桥蛋白抗体特异性高，制备过程相对简单，成本低廉。


图I为本发明抗骨桥蛋白单链抗体的结构示意图；图2为实施例6诱导表达产物纯化前后的凝胶电泳图；其中，I为产物纯化前，2为产物纯化后；图3为实施例7本发明抗体浓度与OD45tl关系曲线图；图4为实施例8本发明抗体检测肿瘤细胞株(卵巢癌和肺癌细胞株)骨桥蛋白(OPN)表达的结果。OPN是包被纯化后的骨桥蛋白(lyg/ml)。
具体实施例方式本发明采用专利申请01813639. 7公开的方法构建人单链抗体文库，并在人单链抗体文库中筛选OPN抗体，具体实施过程如下实施例I逆转录和扩增得到人抗体重链和轻链DNA以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的poly A+RNA(购自Clontech)为模板，并使用从Clontech购得的逆向转录酶试剂盒，以oligo(dT)和随机引物(randomprimers)为引物，根据Clontech试剂盒所提供的方法指南，将polyA+RNA逆向转录成cDNA。以上述cDNA为模板，使用一系列识别人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的引物，应用PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链的可变区。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下第一组人抗体重链可变区(VH)基因的5’ -端引物VHlb :5，-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTGCAG GAG TC(C/G)G
VH2b :5’ -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTA CAG CTGCAG CAG TCAVH3b :5’ -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTACAG CAG TGG GVH4b:5’ -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GAG GTG CAG CTG(G/T)TG GAG(A/T)C(C/T)VH5b :5，-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTC CAGCT(G/T)GT(A/G)CAG TCTGGVH6b :5，-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG(A/G)TC ACCTTG AAG GAG TCT GVH7b :5’ -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTGGTG (C/G) A (A/G) TCTGG·
第二组人抗体重链可变区(VH)基因的3’ -端引物VHlf :5’ -GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GAC(A/G)GT GAC CAG GGT GVH2f :5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GACGGT GAC CAG GGT TVH3f :5’ -GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA AGA GAC GGTGAC CAT TGTVH4f :5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GACGGT GAC CGT GGT CCVH5f :5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC GGT TGG GGCGGA TGC ACT CCVH6f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC (C/G)GA TGG GCCCTT GGT GGA(A/G)GC第三组人抗体λ -轻链可变区(V λ )基因的5’ -端引物VLlb :5，~GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT GT (C/G)(C/G/T)TG ACG CAG CCG CCVL2b :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT G (A/T) GCTG AC (A/T) CAG CCA CVL3b :5，~GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT GAG CTGA(C/T)(A/G)CAG C(C/T)A CCVL4b :5’ -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CCT GTGCTG ACT CA (A/G) (C/T)CVL5b :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG (A/G/T)CTGTG GTG AC(C/T)CAG GAG CCVL6b :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CC (A/T) G (G/T) G CTG ACT CAG CC (A/C) CCVL7b :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TCT GAG CTG A(C/G)T CAG GA(C/G)CCVL8b :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT G(C/T) (C/T)CTG A(C/T)T CAG CCTVL9b :5， -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC C第四组人抗体λ-轻链可变区(V λ)基因的3’ -端引物VLlf :5’ -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TAG GAC GGT(C/G)A(C/G)CTT GGT CCVL2f :5’ -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA GAG GAC GGT CAG CTG GGT GC第五组人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的5’ -端引物VKlb :5，~GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAC ATC C(A/G)G (A/G/T)TG ACC CAG TCT CCVK2b :5’~GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ATT GT (A/G)(A/T)TG AC (A/G)CAG TCT CCVK3b :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAT ATT GTG(A/C)TG AC(C/G/T)CAG(A/T) CT CCVK4b :5’ -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ACG ACACTC ACG CAG TCT C第六组人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的3’ -端引物VKlf :5’ -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT TTC CACCTT GGT CCVK2f:5’ -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT CTCCA(C/G)CTT GGT CCVK3f :5’ -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT ATC CACTTT GGT CCVK4f :5’ -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT AAT CTC CAGTCG TGT CC
PCR法扩增人抗体中的重链可变区(VH)时应用上述第一组引物与第二组引物的组合，即有42个PCR反应。类似地，扩增人抗体中的λ-轻链可变区(V λ)时应用上述第三组引物与第四组引物的组合，即有18个PCR反应。扩增人抗体中的k轻链可变区(Vk)时应用上述第五组引物与第六组引物的组合，即有16个PCR反应。第I组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2(Hua SB, Luo Y，Qiu M，Chan E，ZhouH,Zhu L. (1998)Gene. 215 :143-152.)(Hua SB,Qiu M，ChanE，Zhu L，Luo Y. (1997)Plasmid38:91-96.)多克隆位点上游的同源序列(下划线部分)；第4组和第6组引物中包含有与酵母双杂交载体PACT2多克隆位点下游的同源序列(下划线部分)；而第2组、第3组和第5组引物中包含有连接肽(linker)的序列(下划线部分)。连接肽用于连接抗体的重链和轻链的可变区。PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链可变区的反应条件如下
5.0μ PCR 缓冲液(IOx)
Ι.ΟμΙ 35-端引物(10 μΜ)
1.0μ 5，-端丨物(10μΜ>
5.0μ cDNA 底物 Ι.ΟμΙ dNTP (IOmM)
36 μ!水I. O单位Taq聚合酶(Takara公司生产)将上述各组分混合均匀后置于PCR仪(Applied BioSystems公司)中进行反应。PCR反应的参数为解链94°C，I分钟；退火50°C，I分钟；延伸72°C，2. 5分钟，循环30次。实施例2连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列以实施例I中PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板，以引物7为上游引物，弓I物8为下游引物，采用PCR法进行扩增，反应条件同上。引物7序列为载体PACT2多克隆位点的上游同源序列，引物8序列为连接肽反链序列。引物7 (pACT2上游同源序列)5， -ACC CCA CCA AAC CCA AAA AAA GAG ATC TGT ATG GCTTAC CCA TAC GAT GTTCCA GAT TAC引物8 (连接肽序列反链)5’ -ACT GCC TCC ACC ACC GCT GCC ACC TCC GCC AGA TCCTCC GCC GCC TGA TCCACC ACC GCC以实施例I中PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板，以引物9和引物10分别为下游引物和上游引物，采用PCR法进行扩增，反应条件同上。引物9为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列，引物10为连接肽顺链序列。引物9 (pACT2下游同源序列)5’ -GAG ATG GTG CAC GAT GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGCGGG GTT TTT CAG TATCTA CGA引物10 (连接肽序列顺链)
5， -GGC GGT GGT GGA TCA GGC GGC GGA GGA TCT GGC GGAGGT GGC AGC GGT GGTGGA GGC AGT实施例3将人抗体重链和轻链DNA通过连接肽序列连接成单链抗体将实施例2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合。以该混合DNA为模板，以引物7和引物9分别为上游引物和下游引物，进行PCR扩增，反应条件同实施例I。得到包括人抗体重链DNA序列、轻链DNA序列、载体pACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体(scFv)DNA,如图I所示。实施例4构建人单链抗体(scFv)基因文库上述实施例3所述的单链抗体(scFv)DNA两侧接有酵母双杂交载体pACT2 (原Clontech公司生产)多克隆位点两侧的同源序列。将上述实施例3所述的单链抗体(scFv)DNA与经限制性内切酶(BamHI和EcoRI)处理后的酵母双杂交载体pACT2按照原Clontech·公司提供的方法(Yeast Protocol Handbook, PT3024-1)将其共同转化进入酵母菌株Y187(基因型 M4rcrura3-52，his3-200，ade2-101, lys2_801, trp 1-901，leu2_3，112，gal4, gal80,URA3: :GALlUAS-GALlTATA-IacZ)内，经细胞内同源重组后将单链抗体(scFv)DNA整合到pACT2载体上，从而得到酵母双杂交单链抗体(scFv)文库。单链抗体(scFv)DNA片段与pACT2载体上的Gal4激活区域(Activation Domain, AD)融合在一起。为检查这个人单链抗体(scFv)文库的质量，随机挑出了 21个克隆。对插入片段测序分析表明所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体(ScFv)DNA片段(数据未显示)，而且所有单链抗体(scFv)DNA序列都是独特的。上述经同源重组而得到酵母双杂交单链抗体(scFv)基因文库中抗体DNA拷贝数大约有IXIO8个，可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。实施例5筛选抗体使用人骨桥蛋白(OPN)作为抗原对酵母双杂交单链抗体scFv文库进行筛选。将编码人OPN的DNA克隆进入载体pGBKT7 (原Clontech公司)构建出pGBK_0PN。pGBK-OPN编码Gal4 DNA结合区域(Binding Domain,即BD)并融合人OPN在其C端。在编码人OPN的DNA序列得到验证后，pGBK-OPN质粒DNA转化进酵母菌株AH109(基因型 MATa， ura3-52， his3-200， ade2-101， trpl-901， leu2-3，112， gal4 ,gal80，LYS2: :GAL1uas_GAL1tata_HIS3，GAL2uas_GAL2tata_ADE2，URA3: :MELlUAS_MELlTATA_lacZ)(Clontech公司)。带有pGBK-OPN质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培养基(SD/-W)上生长。将等量的含有pGBK-OPN的MATa型酵母细胞(AH109菌株)与包含单链抗体scFv文库的MAT型酵母细胞Y187菌株进行共同培养时，此二型细胞即可交配结合。载有scFv文库的pACT2载体含有LEU2基因，pGBK-OPN包含TRPl基因。包含两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和丝氨酸的酵母合成培养基(SD/-LW)。存在scFv/OPN相互作用的细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2和HIS3，从而使得酵母细胞可以生长在缺乏腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的培养基(SD/-AHLW)上，并在该平板培养基上形成菌落。我们在上述筛选培养基(SD/-AHLW)上总共挑选出16个菌落。然后，对这些菌落进行进一步的分析。首先,按Clontech公司的方法使用半乳糖苷酶检测法检测IacZ表达。存在scFv/OPN相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告基因lacZ，从而能测得酵母细胞内表达的半乳糖苷酶。检测酵母细胞半乳糖苷酶的方法如下(I)上述酵母在筛选培养基(SD/-AHLW)平板上生长。(2)将酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上。(3)将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中，使细胞破裂。(4)将滤纸从液氮中取出，并置于30°C的烘箱内。重复步骤3和4 二次。(5)将滤纸铺于适量的X-gal溶液中，并置于37°C的温箱内约15分钟。若带有菌 落处显示蓝色，表明为半乳糖苷酶阳性。X-gal溶液配方如下
16.1 g/L Na,iIP0i*71120 5.50 g/l. NaH；,PO|*HiO
0.75 g/L KCi
0,246 g/L MgSO4WH2O 35 mg/L X-gal
(5 -bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galacto p>-Ti5 nosidc )
5 mM β-流基乙醇pi I 7.0检测结果上述挑选出的16个菌落中有9个是半乳糖苷酶阳性的，表明在这些菌落的细胞内另一报告基因IacZ也被激活了。其次，对上述9个半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析，以确定单链抗体scFv是特异性地与OPN部分结合，而不是与其它部分。将含有scFv的pACT2质粒DNA从上述9个半乳糖苷酶阳性的酵母中提取出来。并分别与pGBKT空载体DNA，或与含有编码融合Gal4-DNA结合区(BD)和人核纤层蛋白C编码序列的质粒pGBKT-Lam (Clontech公司)的DNA，共同转化到AH109酵母细胞内。转化后的酵母细胞先铺于SD/-LW平板培养基上生长，然后转移到SD/-AHLW平板培养基上。并进一步使用半乳糖苷酶分析。经上述方法对SCFv进行特异性分析后，我们得到3个对人OPN具有特异性的单链抗体scFv。然后，对上述3个对人OPN具有特异性的单链抗体scFv进行测序分析。使用ABI自动测序仪测定scFv的DNA序列。分析这些单链抗体scFv克隆的序列表明有二个不同的抗人OPN的单链抗体。其中与克隆号#0PN-3相同的有2个，而与克隆号#0PN-8相同的则有I个。克隆号#0PN-3的单链抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，DNA序列如SEQ ID NO. 3所示；VL的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，DNA序列如SEQ ID NO. 4所示。重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO. I)如下
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYffSfflRQPPGKGLEfflGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDYYDFffSGYYDAFDIffGQGTMVTVSS下划线部分依次为重链可变区中的三个高变区⑶RH1XDRH2和⑶RH3的氨基酸序列。轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)如下QSALIQPASVSGPPGQSITISCTGSSSDVGDYYYVSffYQQHPGKAPKLLIYDVNYRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYRDTQILGVFGGGTKLTVL下划线部分依次为轻链可变区中的三个高变区⑶RL1XDRL2和⑶RL3的氨基酸序列。实施例6抗体表达与纯化
将抗人OPN的单链抗体scFv的DNA克隆到蛋白质表达载体中pET27b (+) (LifeTechnologies 公司)而得到 pET27b_0PN。克隆后的 pET27b_0PN，在 scFv 的 N 端是 pelB 序列(可将表达后的scFv蛋白质分泌到表达细菌E. coli的周质腔periplasmic space中)，而C端含有一段编码HSV标记物和一个6x His标记物(可用于蛋白质的纯化)的序列。将pET27b-0PN转化入蛋白质表达细菌E. coli菌株BL21 DE3 (Novagen公司)。并按照该公司提供的方法用IPTG(浓度O. 5mM)诱导表达和分离抗人OPN的单链抗体scFv蛋白质。因为ScFv蛋白质的C端含有一个6x His标记物,可以应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱(Qiagen公司)来纯化scFv蛋白质。纯化前后蛋白质用SDS-PAGE凝胶电泳的分析，结果如图2所示。实施例7酶标免疫法(ELISA)测试抗OPN的scFv特性重组人骨桥蛋白(OPN)的蛋白质购自中国义翘神州生物技术有限公司。用于酶标免疫法(ELISA)的96-孔板(MaxiSorp板)购自Nunc公司。方法如下(I)上述96-孔板首先用OPN包被，在2_8°C过夜。(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock(购自Pierce公司)作封闭处理。(3)纯化了的抗OPN单链抗体在O. 02% BSA中作系列稀释后加入已包被有OPN的96-孔中，与OPN结合。(4)将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了 5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体(购自Life Technologies公司)用来检测结合了的单链抗体(注在scFv的C端含有一个HSV标记物)。(5)将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了 10000倍的山羊抗鼠IgG抗体并偶联有HRP (辣根过氧化物酶)的偶联物(购自Sigma公司)。(6)将96-孔板最终清洗后，应用购自Sigma公司的HR底物TMB试剂作显色处理。(7)最后，反应用0. 5M的硫酸终止，并检测450nm的吸收光谱。 结果如图3所示，结果说明抗人OPN单链抗体能有效地结合人骨桥蛋白。实施例8用抗OPN抗体测试OPN在肿瘤细胞的表达用纯化后的抗OPN抗体测定OPN在肿瘤细胞株的表达。实验步骤如下(I)在24孔细胞培养板上用无血清培养基(Gibco公司)中首先培养人卵巢癌细胞株0VCAR3、0V1063、SK0V3，人肺癌细胞株A549、H1299，和阴性对照细胞株C0S-1。每孔加入5xl05细胞数。
(2)在37°C的CO2培养箱内培养48小时。(3)从细胞培养上清液取100微升，加入96-孔板(MaxiSorp板，Nunc公司)包被，在2-8°C过夜。重组人骨桥蛋白(OPN)的蛋白质购自中国义翘神州生物技术有限公司。(4)包被后的96-孔板再用SuperBlock(购自Pierce公司)作封闭处理。(5)纯化了的抗OPN单链抗体在O. 02% BSA中作系列稀释后加入已包被有细胞培养上清液的96-孔中。(6)将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了 5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体(购自Life Technologies公司)用来检测结合了的单链抗体(注在scFv的C端含有一个HSV标记物)。(7)将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了 10000倍的山羊抗鼠IgG抗体并偶联有HRP (辣根过氧化物酶)的偶联物(购自Sigma公司)。 (8)将96-孔板最终清洗后，应用购自Sigma公司的HRP底物TMB试剂作显色处理。(9)最后，反应用O. 5M的硫酸终止，并检测450nm的吸收光谱。结果如图4所示，结果说明抗人OPN抗体能有效检测卵巢癌细胞和肺癌细胞分泌的骨桥蛋白。
权利要求
1.一种抗骨桥蛋白抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为GGSFSGYYW、IYYSGSTYYNPSLKS、HDYYDFWSGYYDAFDI，所述轻链可变区的三个高变区⑶RL1、⑶RL2、⑶RL3的氨基酸序列分别为TGSSSDVGDYYYVS、DVNYRPS、SSYRDTQILG。
2.根据权利要求I所述的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根据权利要求I所述的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根据权利要求I所述的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，所述抗体为单链抗体。
5.编码权利要求I 4任一所述抗骨桥蛋白抗体的基因。
6.权利要求I 4任一所述抗骨桥蛋白抗体在检测卵巢癌细胞和肺癌细胞中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗骨桥蛋白抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为GGSFSGYYW、IYYSGSTYYNPSLKS、HDYYDFWSGYYDAFDI，所述轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为TGSSSDVGDYYYVS、DVNYRPS、SSYRDTQILG。本发明抗骨桥蛋白抗体特异性高，制备过程相对简单，成本低廉。
文档编号C12N15/11GK102942630SQ201210395068
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者华绍炳, 侯伟 申请人:杭州德同生物技术有限公司