专利名称：一种从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种工业中分离提取纤维素酶的方法，尤其涉及一种从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法。
背景技术：
纤维素类资源是世界上最廉价、储量最丰富的可再生资源。我国是个农业大国，小麦秸杆等木质纤维素储量更是丰富。在许多农村小麦秸杆等甚至多被焚烧，这不仅造成了环境的严重污染还造成了木质纤维素原料的大量浪费。因此，如何将这种可再生资源合理利用成了急需应对的难题，在解决这一问题上各国工作者做了大量研究。目前，由纤维素酶酶解木质纤维素制成燃料乙醇是能大规模利用木质纤维素的最有效方法之一，同时也是新能源方面研究的热点。如美国提出到2020年生物质燃料油取代全国燃油消耗量10%，欧盟委员会提出20%的运输燃料由燃料乙醇等生物燃料替代等计划。但木质纤维素制乙醇仍存在生产成本高，与传统能源相比没有太大优势及产率低等缺陷。其中，纤维素酶的生产成本居高不下是导致木质纤维素制乙醇生产成本难以降低的主要因素之一。因此，为了促进木质纤维素的合理利用及新能源的开发，降低纤维素酶的生产成本成了最亟待解决的难题。在从发酵液中分离提取纤维素酶的工业级制备方面，柱层析分离方式由于高成本与操作的复杂性等原因很难有效的放大到工业规模。目前，工业中纤维素酶的分离方法主 要有硫酸铵盐析和乙醇沉淀等。但是硫酸铵盐析后会产生大量的盐较难除去与回收，而乙醇沉淀的成本又相对较高，从而制约了木质纤维素原料及纤维素酶的大规模工业化应用。
发明内容
本发明的目的在于针对一般提取纤维素酶方法的弊端，提供一种从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，本发明采用改进的单宁沉淀法分离提取经产纤维素酶微生物发酵产生的纤维素酶，并采用真空冷冻干燥法制备成粉末状纤维素酶产品，使纤维素酶的回收率能够达到90-95%，具有用时短、能耗小、操作简单、纤维素酶收率高的优点，克服了分离提取纤维素酶阶段在整个木质纤维素制乙醇工艺中成本过高、操作复杂等难题，适用于纤维素酶工业化大规模制备。本发明的技术方案为一种从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，包括以下步骤步骤一、发酵液澄清，将产纤维素酶微生物发酵140 200h左右的发酵液进行压滤，得到发酵澄清液；步骤二、单宁沉淀，将所述发酵澄清液加入搅拌罐中，以一定的转速进行搅拌，同时调节所述发酵澄清液的PH值至4. O 6. 0，将一定量的单宁溶液加入搅拌罐中的发酵澄清液中，并持续搅拌一定时间，进行纤维素酶的沉淀；步骤三、沉淀收集，将经过单宁沉淀的发酵澄清液进行压滤，收集沉淀，得到所述纤维素酶。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，步骤一中用板框压滤机进行压滤，包括以下步骤步骤一、一级压滤，将所述发酵液用装有5 10层纱布的板框压滤机进行压滤，得到一级滤液；步骤二、二级压滤，将得到的所述一级滤液用装有I 10 μ m滤布的板框压滤机进行压滤，得到所述发酵澄清液。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，对步骤一中得到的所述发酵澄清液和步骤三中经单宁沉淀收集到的纤维素酶沉淀分别用滤纸酶活力测定方法测定其纤维素酶活力。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，所述单宁溶液的配 置方法为按照每100L发酵澄清液中加入400_1000g单宁的比率，根据发酵液的体积，将相应量浓度为3 10g/L的单宁用柠檬酸缓冲液进行溶解，得到单宁溶液，其中，所述柠檬酸缓冲液PH值为4. O 6. O。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，步骤二中所述搅拌的转速为50 200r/min。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，步骤三中所述持续搅拌的时间为I 5h。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，步骤一中所述加入柠檬酸缓冲液的量为使所述单宁完全溶解的量。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，步骤三中可将收集的沉淀经真空冷冻干燥制得粉末状纤维素酶产品。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，所述真空冷冻干燥的条件是真空度为9 19Pa，温度为-45 _55°C，抽真空12 36h直至成粉术状无水分时为止。优选的是，所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，所述的调节pH的酸碱选择2mol/L浓度的H2SO4和NaOH。本发明具有以下有益效果通过采用改进的单宁沉淀法分离提取经产纤维素酶微生物液体深层发酵产生的纤维素酶，并采用真空冷冻干燥法制备成粉末状纤维素酶产品，使纤维素酶的回收率能够达到90-95%，具有用时短、能耗小、操作简单、纤维素酶收率高的优点，克服了分离提取纤维素酶阶段在整个木质纤维素制乙醇工艺中成本过高、操作复杂等难题，适用于纤维素酶工业化大规模制备。
具体实施例方式下面对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。一种从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，包括以下步骤步骤一、发酵液澄清，将产纤维素酶的微生物发酵140 200h左右的发酵液进行压滤，得到发酵澄清液；本发明所述产纤维素酶微生物为里氏木霉。步骤二、单宁沉淀,将所述发酵澄清液加入搅拌罐中，以50 200r/min的转速进行搅拌，调节所述发酵澄清液的PH值至4. O 6. 0，将一定量的单宁加入到所述发酵澄清液中，并持续搅拌I 5h，进行纤维素酶的沉淀，其中所述的调节pH的酸碱选择2mol/L浓度的 H2SO4 和 NaOH。步骤三、沉淀收集，将经过单宁沉淀的发酵澄清液进行压滤，收集沉淀，得到所述纤维素酶。可将收集的纤维素酶沉淀经真空冷冻干燥制得粉末状纤维素酶产品。所述真空冷冻干燥的条件是真空度为9 19Pa，温度为-45 _55°C，抽真空12 36h直至成粉末状无水分时为止。所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，步骤一中用板框压滤机进行压滤，包括以下步骤步骤一、一级压滤，将所述里氏木霉发酵液用装有5 10层纱布的板框压滤机进 行压滤，得到一级滤液；步骤二、二级压滤，将得到的所述一级滤液用装有I 10 μ m滤布的板框压滤机进行压滤，得到所述发酵澄清液。所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，对步骤一中得到的所述发酵澄清液和步骤三中经单宁沉淀收集到纤维素酶沉淀分别用滤纸酶活力测定方法测定其纤维素酶活力。通过先后两步测定所述纤维素酶的酶活力，经过计算可得到酶活收率。所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法中，步骤二中所述单宁溶液的配置方法为按照每100L发酵澄清液中加入400_1000g单宁的比率，根据发酵液的体积，将相应量浓度为3 10g/L的单宁用柠檬酸缓冲液进行溶解，得到单宁溶液，其中，所述柠檬酸缓冲液PH值为4. O 6. O ;所述加入柠檬酸缓冲液的量为使所述单宁完全溶解的量。本发明提供的采用单宁沉淀分离提取发酵液中纤维素酶的方法具有以下突出特
占-
^ \\\ ·单宁作为纤维素酶的沉淀剂，是应用单宁能与纤维素酶蛋白通过氢键结合的原理，并且这种氢键的结合具有可逆性。通过实验测定，由于其无效吸附少等原因，在相同条件下这种与单宁结合的纤维素酶的酶解秸杆率要高于相同酶活单位数的发酵液，因此具有很高的应用性。同时单宁既是纤维素酶的沉淀剂也是在制成粉末状产品时纤维素酶的保护剂和防腐剂，因此能进一步的减少成本。本发明操作工艺简单可行、投入设备成本低、能耗小、收率高，适用于大规模工业化生产中分离提取纤维素酶。下面通过实施例对本发明做进一步说明实施例I :将由里氏木霉液体深层发酵200h的发酵液先经过装有5层纱布的板框压滤机压滤进行一级澄清，再经 ο μ m的滤布进行二级澄清。。调节澄清后发酵液的pH为4. 0，调节转速为200r/min。称取3g/L单宁并用pH4. O柠檬酸缓冲液充分溶解后一次性加入到搅拌罐中，搅拌均匀后静置lh。将单宁沉淀后的发酵液经装有10 μ m滤布板框压滤收集沉淀，采用真空冷冻干燥机在真空度llPa，-50°C条件下冻干30h制得粉末状纤维素酶产品。采用国际理论与应用化学联合会推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，测得酶活收率为75%。实施例2:将由里氏木霉液体深层发酵200h的发酵液先经过装有5层纱布的板框压滤机压滤进行一级澄清，再经 ο μ m的滤布进行二级澄清。调节澄清后发酵液的pH为4. 5，将转速调节为150r/min。称取5g/L单宁并用PH4. 5柠檬酸缓冲液充分溶解后一次性加入到搅拌罐中，持续搅拌2h。将单宁沉淀后的发酵液经装有10 μ m滤布板框压滤收集沉淀，采用真空冷冻干燥机在真空度llPa，_50°C条件下冻干30h制得粉末状纤维素酶产品。采用国际理论与应用化学联合会推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，测得酶活收率为82%。
实施例3 将由里氏木霉液体深层发酵200h的发酵液先经过装有5层纱布的板框压滤机压滤进行一级澄清，再经 ο μ m的滤布进行二级澄清。调节澄清后发酵液的pH为5. 0，将转速调节为lOOr/min。称取7g/L单宁并用PH5. O柠檬酸缓冲液充分溶解后缓慢均匀的流加到搅拌罐中，持续搅拌4h。将单宁沉淀后的发酵液经装有IOym滤布板框压滤收集沉淀，采用真空冷冻干燥机在真空度llPa，-50°C条件下冻干30h制得粉末状纤维素酶产品。采用国际理论与应用化学联合会推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，测得酶活收率为89%。实施例4 将由里氏木霉液体深层发酵200h的发酵液先经过装有5层纱布的板框压滤机压滤进行一级澄清，再经 ο μ m的滤布进行二级澄清。调节澄清后发酵液的pH为5. 0，转速调节为50r/min。称取5g/L单宁并用pH5. O柠檬酸缓冲液充分溶解后在2h内缓慢流加到搅拌罐中，并继续缓慢搅拌lh。将单宁沉淀后的发酵液经装有10 μ m滤布压滤收集沉淀，采用真空冷冻干燥机在真空度llPa，-50°C条件下冻干30h制得粉末状纤维素酶产品。采用国际理论与应用化学联合会推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，测得酶活收率为92%。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和实施例。
权利要求
1.一种从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，包括以下步骤 步骤一、发酵液澄清，将产纤维素酶微生物发酵140 200h左右的发酵液进行压滤，得到发酵澄清液； 步骤二、单宁沉淀，将所述发酵澄清液加入搅拌罐中，以一定的转速进行搅拌，同时调节所述发酵澄清液的PH值至4. O 6. 0，将一定量的单宁溶液加入搅拌罐中的发酵澄清液中，并持续搅拌一定时间，进行纤维素酶的沉淀； 步骤三、沉淀收集，将经过单宁沉淀的发酵澄清液进行压滤，收集沉淀，得到所述纤维素酶。
2.如权利要求I所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，步骤一中用板框压滤机进行压滤，包括以下步骤 步骤一、一级压滤，将所述发酵液用装有5 10层纱布的板框压滤机进行压滤，得到一级滤液； 步骤二、二级压滤，将得到的所述一级滤液用装有I 10 μ m滤布的板框压滤机进行压滤，得到所述发酵澄清液。
3.如权利要求I或2所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，对步骤一中得到的所述发酵澄清液和步骤三中经单宁沉淀收集到的纤维素酶沉淀分别用滤纸酶活力测定方法测定其纤维素酶活力。
4.如权利要求I所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，所述单宁溶液的配置方法为 按照每100L发酵澄清液中加入400-1000g单宁的比率，根据发酵液的体积，将相应量浓度为3 10g/L的单宁用柠檬酸缓冲液进行溶解，得到单宁溶液，其中，所述柠檬酸缓冲液pH值为4. O 6. O。
5.如权利要求I所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，步骤二中所述搅拌的转速为50 200r/min。
6.如权利要求I所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，步骤二中所述持续搅拌的时间为I 5h。
7.如权利要求I或4所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，步骤一中所述加入柠檬酸缓冲液的量为使所述单宁完全溶解的量。
8.如权利要求I所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，步骤三中可将收集的沉淀经真空冷冻干燥制得粉术状纤维素酶产品。
9.如权利要求I或8所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，所述真空冷冻干燥的条件是真空度为9 19Pa，温度为-45 _55°C，抽真空12 36h直至成粉术状无水分时为止。
10.如权利要求I所述的从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，其中，所述的调节pH的酸碱选择2mol/L浓度的H2SO4和NaOH。
全文摘要
本发明公开了一种从微生物发酵液中提取纤维素酶的方法，包括以下步骤发酵液澄清将由产纤维素酶微生物发酵140～200h左右的发酵液先经过压滤得到发酵澄清液，将发酵澄清液转移至不锈钢搅拌罐中；单宁沉淀先调节转速将澄清后的发酵液搅拌，同时调节pH在4.0-6.0范围内，然后将一定量的单宁用柠檬酸缓冲液充分溶解后缓慢均匀的加入到搅拌罐中并持续搅拌一定时间。沉淀收集及制备将经单宁沉淀后的发酵液用板框压滤机压滤收集沉淀，然后用真空冷冻干燥机冻干制成粉末状纤维素酶产品。通过本发明的方法提取纤维素酶的用时短、能耗小、操作简单，纤维素酶蛋白收率能达到90～95％。
文档编号C12R1/885GK102876648SQ20121041297
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者宗志友, 马立娟, 赫荣琳, 李晨, 贾文娣, 陈树林 申请人:天津工业生物技术研究所