一种梭菌发酵甜高粱糖汁产溶剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种梭菌发酵甜高粱糖汁产溶剂的方法，所述方法的步骤包括：菌种活化、种子液培养1、种子液培养2和发酵，其特征在于，所述种子液培养2和发酵在培养基为33-39℃的条件下接种，然后进行非厌氧发酵。本发明的方法实现了梭菌在非厌氧条件下大规模发酵甜高粱糖汁产溶剂，有利于工业化应用，降低了工业成本，具有较高的经济价值和应用前景。
【专利说明】一种梭菌发酵甜高粱糖汁产溶剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，是关于一种梭菌发酵甜高粱糖汁产溶剂的方法。
【背景技术】
[0002]产溶剂梭菌(Clostridiumspp.)是一类能够利用鹿糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖等糖类物质作为碳源进行细胞生长和代谢活动，并在其代谢过程中产生丙酮、丁醇和乙醇三联产品的产孢子革兰氏阳性菌，是溶剂发酵工业的最重要菌种来源。丙酮和丁醇可作为溶剂广泛地用于化工、汽车、医药和食品等制造行业；丁醇还是一种优于乙醇、生物柴油的新一代可再生燃料。在石油化工兴起之前，利用产溶剂梭菌生产丙酮和丁醇的发酵工业曾是世界上仅次于酒精发酵的第二大生物技术产业。
[0003]传统的溶剂发酵工业主要以玉米(包括其它淀粉作物)和糖蜜等为原料，经丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.bei jerinckii)等厌氧发酵，同时获得丙酮、丁醇和乙醇(Acetone-gutanol-￡thanol三联产品)的生物加工过程,亦称为“ABE发酵”。产溶剂梭菌发酵生成的总溶剂浓度和溶剂三成分之间的比例，往往随菌种类别、发酵底物和发酵条件而异。常见的产溶剂梭菌有以下4种:丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetoInicum)? 产溶剂梭菌一般的A:B:E比例为3:6:1，A和B占溶剂的90%以上，故也称为“AB发酵”。
[0004]传统的淀粉总溶剂，以糊化淀粉为基料配制发酵液，由于粘度高、溶氧及扩散性能都较差，因而很容易达到梭菌的厌氧生长环境。但以甜高粱糖汁为基料配制的培养基情况正好相反，由于甜高粱糖汁是液体培养基，流动性强，氧气很容易渗透入培养基内部，导致培养基氧含量较高。目前为止，文献报道的所有糖类物质(液体培养基)的发酵都只在实验室规模进行，实验室规模的小试发酵可通过厌氧箱或厌氧罐来保证厌氧环境，而工业大容量发酵罐中糖汁液体的厌氧发酵未有前人经验可循。虽然理论上可通过向发酵罐通氮气的方法来尽量排除发酵罐和培养`基中的氧气，但势必会增加氮气和配套设备的成本，不利于工业生产。因此，甜高粱糖汁发酵产总溶剂首先需要解决非厌氧环境下菌种的接种、增殖和发酵问题，力求在现有淀粉总溶剂厂成熟技术和设备基础上，使甜高粱糖汁这类液体物质发酵总溶剂达到与厌氧条件下一样的溶剂浓度和生产效率。
【发明内容】
[0005]批式发酵和补料发酵与实验室厌氧箱发酵相比，主要就是需要解决非厌氧环境下的梭菌接种和扩容培养问题，这是梭菌后续连续发酵的基础。
[0006]本发明的第一个目的在于提供一种梭菌发酵产溶剂的方法。
[0007]本发明的第二个目的在于提供所述方法用于梭菌发酵产溶剂的应用。
[0008]作为本发明的第一个方面，一种梭菌发酵产溶剂的方法，所述方法的步骤包括:菌种活化、种子液培养1、种子液培养2和发酵,其特征在于,所述种子液培养2和发酵在培养基为33-39°C的条件下接种，然后进行非厌氧发酵。[0009]根据本发明，所述梭菌包括:丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌和糖乙酸多丁醇梭菌。
[0010]根据本发明的优选实施例,所述糖丁酸梭菌为Clostridium saccharobutylicumP262。
[0011]根据本发明，所述菌种活化的条件为:
[0012]活化温度为:33_35°C ;活化时间为:10_24h ；
[0013]菌种活化的培养基组成:(NH4)2S042g/L，K2HPO4Ig/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4 ? 7H200.lg/L, FeSO4 ? 7H200.015g/L, CaCl20.01g/L, MnSO4 ? H2O0.01g/L, CoCl20.02g/L, ZnSO40.02g/L,胰蛋白胨2g/L,酵母提取物lg/L,葡萄糖20g/L,刃天青0.001g/L。
[0014]根据本发明，所述种子液培养I的条件为:
[0015]培养温度为:33_35°C ;培养时间为:12_16h。
[0016]种子液培养的培养基组成:甜高粱糖汁20-30g/L ；CaC03lg/L ； (NH4)2SO4L 5g/L ；pH5-7。
[0017]根据本发明，所述种子液培养2的条件为:
[0018]培养温度为:33_35°C ;培养时间为:12_16h。
[0019]种子液培养的培养基组成:甜高粱糖汁20-30g/L ；CaC03lg/L ； (NH4)2SO4L 5g/L ；pH5-7。
[0020]根据本发明，所述发酵的条件为:
[0021]发酵温度为:26_39°C ;发酵时间为:12_136h。
[0022]发酵的培养基组成:甜高粱糖汁40_60g/L ； CaCO31 g/L ； (NH4)2SO4L 5g/L ;pH5_7。
[0023]根据本发明，所述发酵为批式发酵或补料发酵。
[0024]根据本发明，所述发酵包括1-2个发酵罐发酵。
[0025]作为本发明的第二个方面，所述的梭菌发酵产溶剂的方法用于梭菌发酵产溶剂的应用。
[0026]本发明的有益效果:
[0027]1、本发明解决了非厌氧环境下菌种的接种、增殖和发酵问题，接种时控制培养基温度为33_39°C，保持在无氧或氧气较少的条件下接种，然后进行发酵，结果显示梭菌在流动性较强的甜高粱糖汁培养基中能够较好地发酵产溶剂；
[0028]2、本发明的方法不需要通氮气等额外的成本和劳动，操作简便，成本低。
[0029]本发明的方法实现了梭菌在非厌氧条件下大规模发酵产溶剂，有利于工业化应用，降低了工业成本，具有较高的经济价值和应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为梭菌Clostridium saccharobutylicum P262批式发酵产溶剂的产物结果。
[0031]图2为梭菌Clostridium saccharobutylicum P262批式发酵产溶剂的残糖变化结果。
[0032]图3为梭菌Clostridium saccharobutylicum P262批式发酵产溶剂的温度和pH
变化结果。
[0033]图4为梭菌Clostridium saccharobutylicum P262补料发酵产溶剂的种母罐发酵的产物结果，其中，虚线代表补料。
[0034]图5为梭菌Clostridium saccharobutylicumP262补料发酵产溶剂的种母罐发酵的温度和PH变化结果，其中，虚线代表补料。
[0035]图6为梭菌Clostridium saccharobutylicumP262补料发酵产溶剂的育种罐发酵的产物结果，其中，虚线代表第二次移种。
[0036]图7为梭菌Clostridium saccharobutylicumP262补料发酵产溶剂的育种罐发酵的温度和PH变化结果，其中，虚线代表第二次移种。
【具体实施方式】
[0037]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于实施本发明而非用于限定本发明的范围。
[0038]本发明中使用的菌株为Clostridium saccharobutylicum P262,购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。
[0039]以下实施例中使用的CGM培养基配方如下:
[0040](NH4) 2S042g/L, K 2HPO41 g/L, KH2PO40.5g/L, MgSO4 ? 7H200.lg/L, FeSO4 ? 7H200.015g/L, CaCl20.01g/L, MnSO4 ? H2O0.01g/L, CoCl20.02g/L, ZnSO40.02g/L，胰蛋白胨 2g/L，酵母提取物lg/L,葡萄糖20g/L,刃天青0.001g/L。
[0041]以下实施例中使用的甜高粱糖汁种子培养基配方如下:
[0042]甜高粱糖汁20-30g/L, (NH4)2SO4L 5g/L，CaCO31 g/L, pH5_7。
[0043]以下实施例中使用的甜高粱糖汁发酵培养基配方如下:
[0044]甜高粱糖汁40_60g/L，(NH4)2SO4L 5g/L，CaCO31 g/L, pH5_7。
[0045]溶剂和酸以气相色谱内标法测定，异丁醇和异丁酸做内标，以配置有Grace公司ECTM-WAX毛细管色谱柱的安捷伦7890型气相色谱仪进行测定。进样量I U 1，分流比25:1。分析条件为:柱温85°C，氮气5ps1.，5.5min后，升温至150°C;氮气30psi，保持3分钟，氢气30mL/min,空气400mL/min，尾吹25mL/min ;进样区温度250°C，氢火焰检测区温度为300°C。
[0046]糖以液相色谱法(HPLC)测定，分析方法如下:取样品清液，用无离子水稀释20倍，以配置有suger-parkl色谱柱的安捷伦2100型液相色谱仪进行测定。进样量5 u L，柱温700C，0.6mL/min流速，水相，视差检测器温度55°C。
[0047]实施例1、梭菌批式发酵产溶剂
[0048]1.1、种母罐中试发酵
[0049]菌种活化:取50iiL Clostridium saccharobutylicum P262 甘油管菌种接入 5mLCGM培养基厌氧培养10-24h，培养温度为33-35°C。最佳状态种子液的0D_约0.8-1.0，此时生长旺盛，大量产气。
[0050]种子液培养1:取3mL CGM培养液接入300mL甜高粱糖汁培养基厌氧培养，培养温度为 33-35°C。
[0051]种子液培养2:12h后分别取60mL甜高粱糖汁培养液接入灭菌后冷却至33_35°C的6L甜高粱糖汁培养基/10L瓶中(即接种量为l%(v/v，下同))，加盖硅胶塞后置于普通培养箱，33°C培养约16h后，将6L培养物用于种母罐接种。
[0052]种母罐培养基配料为:初糖浓度:49.76g/L(含蔗糖5.67g/L，葡萄糖17.55g/L，果糖 26.54g/L) ；CaCO3:lg/L ； (NH4)2SO4:1.5g/L ;初始 pH5.1 ;物料量:2.36m3。
[0053]初始发酵条件为:种母罐培养基接种温度:38.80C。
[0054]24h后种母罐温度降至33 °C，48h时罐温为29.7 V。
[0055]种母罐接种后，每隔一定时间取样一次，分析溶剂、酸、残糖、pH，温度由中试车间DCS在线记录。整个发酵过程的各参数变化情况如图1-3所示。
[0056]溶剂生产情况如图1所示，溶剂在42h后趋于稳定，最终产溶剂16.53g/L(其中丙酮6.93g/L,乙醇0.58g/L, 丁醇9.02g/L), 丁醇比例约占55%。残糖变化情况如2所示，42h后葡萄糖和蔗糖基本被耗完，剩余3g/L果糖，糖利用率为94%，溶剂-糖转化率为0.33g/g糖。温度和PH变化情况如图3所示，因种母罐无恒温装置，随着发酵时间延长，温度从最初的约39°C下降到72h的26°C，pH变化符合溶剂发酵的一般规律，即先产酸然后酸被回用。
[0057]从图1可知，发酵42h已达终点。以此计算生产强度为:16.53g/L + 42h=0.393g/L ? h0
[0058]由以上结果可知，当接种温度为38.8°C时，梭菌Clostridium saccharobutylicumP262在非厌氧条件下培养能够正常发酵产溶剂，当发酵42h时，糖被大部分利用完，总溶剂产量为16.53g/L，其中丁醇比例为55%。
[0059]1.2、对照
[0060]以中试种母罐相同的6L培养物为种子，在实验室同步进行一个6L瓶的对照发酵，接种量为0.5%，于33°C普通培养箱恒温发酵。68h的各参数变化情况如表1所示。
[0061]表1、6L瓶培养基发酵68h结果`
【权利要求】
1.一种梭菌发酵甜高粱糖汁产溶剂的方法，所述方法的步骤包括:菌种活化、种子液培养1、种子液培养2和发酵，其特征在于，所述种子液培养2和发酵在培养基为33-39°C的条件下接种，然后进行非厌氧发酵。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梭菌包括:丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌和糖乙酸多丁醇梭菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述糖丁酸梭菌为ClostridiumsaccharobutyIicum P262。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种活化的条件为: 活化温度为:33-35°C ;活化时间为:10-24h ；
菌种活化的培养基组成:(NH4) 2S042g/L，K2HPO41g/L, KH2PO40.5g/L，MgSO4 ? 7H200.lg/L，FeSO4 ? 7H200.015g/L, CaCl20.01g/L, MnSO4 ? H2O0.01g/L, CoCl20.02g/L, ZnSO40.02g/L，胰蛋白胨2g/L,酵母提取物lg/L,葡萄糖20g/L,刃天青0.001g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子液培养I的条件为: 培养温度为:33-35°C ;培养时间为:12-16h。 种子液培养的培养基组成:甜高粱糖汁20-30g/L ；CaC03lg/L ； (NH4) 2S041.5g/L ；pH5-7。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子液培养2的条件为: 培养温度为:33-35°C ;培养时间为:12-16h。 种子液培养的培养基组成:甜高粱糖汁20-30g/L ；CaC03lg/L ； (NH4) 2S041.5g/L ；pH5-7。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为: 发酵温度为:26-39°C ;发酵时间为:12-136h。 发酵的培养基组成:甜高粱糖汁 40-60g/L ；CaC03lg/L ； (NH4)2SO4L 5g/L ;pH5_7。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵为批式发酵或补料发酵。
9.如权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述发酵包括1-2个发酵罐发酵。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法的应用，其特征在于，用于梭菌发酵甜高粱糖汁产溶剂。
【文档编号】C12P7/28GK103773816SQ201210413833
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月25日 优先权日:2012年10月25日
【发明者】戎帮雄, 李治林, 邵丽君, 杨晟, 张志刚, 杨蕴刘, 蒋宇, 陈军, 姜卫红 申请人:上海工业生物技术研发中心, 兴安盟博源生物能源有限公司