一种提高维生素c中间体2-酮基-l-古龙酸生产效率的方法

一种提高维生素c中间体2-酮基-l-古龙酸生产效率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法以山梨糖为底物，以氧化葡糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌为菌种混菌发酵制备2-酮基-L-古龙酸，在整个发酵过程中，维持发酵液中高溶解氧浓度，以促进菌体生长、提高2-酮基-L-古龙酸的转化效率，实现2-酮基-L-古龙酸的高效生产。本发明缩短了发酵周期，提高了产物浓度，显著提高了2-酮基-L-古龙酸生产效率，经济效益好。
【专利说明】一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法，具体为在发酵生产过程中通入富氧空气，提高发酵液中的溶解氧浓度，以提高2-酮基-L-古龙酸生产效率，属于维生素C生产【技术领域】。
【背景技术】
[0002]维生素C又称L-抗坏血酸，它能参与体内多种氧化还原反应及羟化反应，是一类重要的细胞代谢氧化还原化合物，在人体内起到必不可少的重要生理作用，如治疗人类坏血病，增强人体抵抗力。绿色植物能够自己合成维生素C，然而人和许多动物由于身体肝脏中缺少古洛内酯氧化酶，因此不能自己合成，必须从外界摄取。目前维生素C已广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品等领域。并且随着其用途的开发和人们物质文化生活水平的提高,对维生素C的需求量也不断增加。
[0003]1933年，德国化学家Reichstein等发明了以化学合成法为主的莱氏法，是最早工业化生产维生素C的方法，但此法合成路线过长，有毒有害的中间产物以及有机原料消耗量多，导致维生素C生产成本较高。七十年代初，我国首创了维生素C二步发酵法并将其应用于工业生产。该法在莱氏法一步发酵的基础上，采用混菌发酵，使山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，工艺简单、成本低、无污染，是目前维生素C工业生产的主要方法。
[0004]维生素C生产中采用两步发酵获得中间体2-酮基-L-古龙酸，第一步是在醋酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖，此步发酵工艺成熟，发酵周期约为20 h，且转化率很闻，现已能达98%以上；第二步是将L-山梨糖进一步氧化生成2-酮基-L-古龙酸，此步发酵由两种微生物混菌发酵进行，一种为氧化葡萄糖酸杆菌(又名氧化葡糖酸杆菌，拉丁文命名为Gluconobacter oxydans),俗称小菌,另一种常采用巨大芽孢杆菌,俗称大菌。小菌能够转化山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸，但其单独培养生长较弱；大菌不能产酸，但和小菌混合培养，能够显著促进小菌产酸。目前维生素C生产第二步发酵，发酵周期约为40-50 h，产物浓度约为80-95 g/L，转化率约为80-90%。第二步发酵周期长、产物浓度和转化率相对较低，因此是限制维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的关键环节。
[0005]为了进一步提高维生素C发酵的生产效率，近年来许多研究机构对维生素C第二步发酵进行了研究。专利200910148114.X公开了一种维生素C第二步发酵菌种制备方法，菌种茄瓶制备过程中，先将小菌接种茄瓶，培养16-48 h，然后再接种大菌，继续培养24-72h，这种条件下，可以提高小菌在混菌中的比例，提高菌种活力，发酵45 h，2-酮基-L-古龙酸可达到100 g/L，转化率达到90%左右，该方法效率有所提高，但是发酵时间仍然较长。专利200910069697.7公开了一种在发酵过程中添加巯基化合物来取代大菌促进小菌的生长和产酸，但其生产效率仍低于大、小菌混菌发酵的效率。专利200910034773.0公开了一种强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，通过添加海藻糖，提高菌体对古龙酸的耐受性，发酵52 h，2-酮基-L-古龙酸可达到69.38 g/L，该方法需要添加海藻糖，海藻糖价格较高，导致生产成本上升，不具有实用性。
[0006]富氧是应用物理或化学方法将空气中的氧气进行收集，使收集后气体中的氧气含量> 21%。随着技术的发展，现已经发展了低温法和膜分离法制备富氧空气，富氧空气制备技术成熟，使得富氧空气成本下降，富氧空气日趋广泛的应用到工业生产中。目前通过富氧空气发酵，提高2-酮基-L-古龙酸生产效率尚未有文献报道。

【发明内容】

[0007]本发明针对现有维生素C生产过程中第二步发酵生产效率低下的问题，提供了一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法。
[0008]维生素C 二步发酵生产方法中，第二步发酵将L-山梨糖混菌发酵产生2-酮基-L-古龙酸的过程中生产效率偏低，主要原因是将山梨糖氧化生成2-酮基-L-古龙酸的氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)(俗称小菌)生长缓慢，且现今公开的小菌菌种转化生产2-酮基-L-古龙酸的效率也较低，致使中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率低。发明人在研究过程中发现，在发酵过程中，通入富氧空气或氧气、提高溶解氧浓度的情况下，可以显著增加小菌的生长速度和数量，同时能够增加小菌转化生产2-酮基-L-古龙酸的效率，提高2-酮基-L-古龙酸的产量和生产效率。发明人进一步的进行了研究，得到了提高2-酮基-L-古龙酸生产效率的技术方案，如下所示:
一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法，以山梨糖为底物，以氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)为菌种混菌发酵制备2-酮基-L-古龙酸，在整个发酵过程中，维持发酵液中高溶解氧浓度，以促进菌体生长、提高2-酮基- L-古龙酸的转化效率，实现2-酮基-L-古龙酸的高效生产。
[0009]在现今混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法中，每个阶段发酵液中溶解氧的浓度变化较大，例如在产酸前期，溶解氧浓度较高，在50%以上,而在发酵中期和后期,溶解氧的浓度减小，在50%以下，在整个发酵过程中发酵液中的溶解氧浓度在5-100%范围内变动。研究发现，在其他主要工艺条件不变的情况下(例如所用的菌种，培养条件等)，整体上提高整个发酵过程中发酵液中的溶解氧浓度可以促进菌体生长，提高2-酮基-L-古龙酸转化速率，缩短发酵周期，提高2-酮基-L-古龙酸的产量，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产，而发酵过程中溶解氧应满足:在整个发酵过程中，溶解氧浓度应始终保持在55-100%范围内。溶解氧浓度越高，其2-酮基-L-古龙酸的产量越高，优选的溶解氧浓度可保持在62.3-100%,更优选可维持在71.3-100%。
[0010]在有氧发酵中，一般都是通入空气，但是空气中氧气浓度较低，要达到溶解氧始终在55%以上比较困难。本发明提高溶解氧浓度可以采用通入氧气或者富氧空气的方式实现，所述富氧空气为氧气体积浓度> 21%的空气，优选氧气体积浓度为30-99%的富氧空气，最优选氧气体积浓度为45-75%的富氧空气。富氧空气可以用现有技术中公开的方法制备，制备技术成熟，成本低，因此优选采用通入富氧空气提高溶解氧浓度。在发酵过程中，氧气或富氧空气一般按照一定的通气比持续通入发酵液中，一般保证通气比为0.2-1.5 L/Lmin即可满足溶解氧浓度要求。
[0011]在不改变其他发酵条件的情况下，仅采用本发明方法提高发酵液中溶解氧浓度后，混菌发酵的时间可由40-50 h缩短至12-20 h，大大提高了生产效率。[0012]上述方法中，混菌发酵过程可以采用现有技术中公开的以山梨糖为底物，采用氧化葡萄糖酸杆菌(即氧化葡糖酸杆菌，下同)和巨大芽孢杆菌为混合菌种的任意混菌发酵的方法，所用的菌种可以是任意现有技术中公开的氧化葡萄糖酸杆菌(简称为小菌)和巨大芽孢杆菌(简称为大菌)，所用的培养基可以根据所用的菌种在现有技术中进行选择，所用的培养条件可以根据现有技术中公开的内容进行选择。
[0013]进一步的，在上述提高发酵液溶解氧浓度的基础上，本发明可以采用优选的氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)TL-1045 CGMCC N0.6188 或 / 和巨大芽抱杆菌 ATCC14581为菌种，使本发明效果更突出，更有利于工业化大生产应用。
[0014]上述氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans) TL-1045 CGMCC N0.6188 的诱变筛选过程为:以筛选得到的氧化葡糖酸杆菌TL-347为出发菌株，TL-347对2-酮基-L-古龙酸的耐受浓度为85 g/L，发酵生产2-酮基-L-古龙酸的产量约为95 g/L。挑取出发菌株氧化葡糖酸杆菌TL-347的单菌落，接入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，加30 ml无菌生理盐水，150 rpm震荡20 min，将菌落打散，制成菌悬液。取菌悬液5 ml加入培养皿中，于40瓦紫外灯下，20-40 cm处照射I min、5 min、10 min,然后将三个处理的菌悬液分别稀释至10_3-10-5，涂布含有筛选培养基(2-酮基-L-古龙酸90-130 g/L，山梨糖15 g/L，胰蛋白胨3 g/L,尿素0.1 g/L,玉米衆4 g/L,牛肉膏1.2 g/L,酵母膏1.2 g/L,磷酸二氢钾I g/L,硫酸镁0.2 g/L，琼脂粉17 g/L, pH 6.7)的平板中，避光培养72 h，挑取平板上的菌落，分别和巨大芽孢杆菌搭配，然后混菌接发酵摇瓶，检测发酵产2-酮基-L-古龙酸效率，将初步筛选的菌株反复多次诱变得到本发明中的2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌TL-1045，其在110 g/L或更高浓度的2-酮基-L-古龙酸中能够正常生长繁殖，其与巨大芽孢杆菌混菌发酵所得发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量在125g/L以上，L-山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率在90%以上。
[0015]对氧化葡糖酸杆菌TL-1045的分类学特征进行研究，如下:
一、氧化葡糖酸杆菌TL-1045的菌体和菌落形态见表1。
【权利要求】
1.一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法，其特征是:以山梨糖为底物，以氧化葡糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌为菌种混菌发酵制备2-酮基-L-古龙酸，在整个发酵过程中，维持发酵液中高溶解氧浓度，以促进菌体生长、提高2-酮基-L-古龙酸的转化效率，实现2-酮基-L-古龙酸的高效生产。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是:整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在.55-100%范围内。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是:整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在.62.3-100% 范围内。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是:整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在71.3-100% 范围内。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征是:采用通入富氧空气或氧气的方式维持发酵液中的高溶解氧浓度；发酵过程发酵周期为12-20 h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是:发酵过程中保持氧气或富氧空气的通气比为0.2-1.5 L/L*min ;所述富氧空气中氧气的体积分数为30_99%。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是:所述富氧空气中氧气的体积分数为45-75%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是:所用氧化葡糖酸杆菌为氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)TL-1045 CGMCC N0.6188 ;所用的巨大芽抱杆菌为巨大芽抱杆菌ATCC 14581。
9.根据权利要求1、2、3、4或8所述的方法，其特征是:混菌发酵时，按照5-20%的接种量将菌种接种到发酵培养基中，在温度27-32°C、转速80-250 rpm条件下发酵12_20h，发酵过程中流加碱性物质溶液控制pH 6.7-7.3，当发酵液中L-山梨糖下降到5-15 g/L时，流加L-山梨糖保持L-山梨糖浓度为10-25 g/L ;发酵培养基组成为:山梨糖20-30 g/L,玉米浆.5-12 g/L，尿素 0.05-0.2 g/L, pH 6.7-7.3。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是:混菌发酵前需要制备种子液，以得到接种量所需数量的菌种，种子液制备包括以下步骤: (1)菌种的活化:将用茄瓶保存的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖酸杆菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，然后27-32°C下培养18-24 h，得活化的菌种液； (2)菌种的分离纯化:用无菌生理盐水将步骤(1)得到的活化菌种液进行梯度稀释，取.10_5-10_7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在27-32 °C下培养4_6天； (3)混菌的培养:用接种环将步骤(2)中10-25个平板上培养得到的全部氧化葡糖酸杆菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成氧化葡糖酸杆菌菌悬液；然后从步骤(2)中平板上选择巨大芽孢杆菌菌落，用接种环在巨大芽孢杆菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小的巨大芽孢杆菌接到氧化葡糖酸杆菌菌悬液中，搅拌混匀制得混菌悬液；取混菌悬液.0.05-0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，27-32°C培养3_5天； (4)种子液的制备:将步骤(3)中茄瓶培养得到的混菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-32°C、80-250 rpm的条件下培养18-24 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶； (5)种子液的扩大培养:将步骤(4)得到的种子液按5-20%的接种量接种到扩大培养基中，在80-250 rpm、富氧空气或氧气通气比0.2-1.5 L/L.π?η、27-32?条件下培养10-15h，所述富氧空气的氧气体积分数为30-99% ； 种子液制备过程中，所用培养基组成如下: 步骤(1)中活化培养基的组成为:山梨糖5-15 g/L，葡萄糖2-5 g/L，酵母膏3-8 g/L,玉米浆 3-10 g/L，尿素 0.05-0.2 g/L, pH 6.7-7.2 ； 步骤(2)中平板培养基组成为:山梨糖5-20 g/L，胰蛋白胨1-5 8/1，尿素0.05-0.2 g/L，玉米浆2-6 g/L，牛肉膏0.5-2 g/L，酵母膏0.5-2.0 g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5 g/L，硫酸镁 0.1-0.3 g/L,琼脂粉 17 g/L, pH 6.7-7.2 ； 步骤(3)中茄瓶培养基组成为:山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸镁1-3 g/L，琼脂粉 17 g/L, pH 6.7-7.2 ； 步骤(4)中种子培养基的组成为:山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米浆5-12 g/L,尿素 0.05-0.2 g/L, pH 6.7-7.2 ； 步骤(5)中扩大培养基组成为:山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米浆5-12 g/L，尿素 0.05-0.2 g/L, pH 6.`7-7.2。
【文档编号】C12R1/01GK103789387SQ201210423489
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年10月30日 优先权日:2012年10月30日
【发明者】张全景, 付吉明, 王乔隆, 郑秀宁, 刘敏, 陈平平, 李慧君 申请人:山东天力药业有限公司