一种胶原蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明属于生物活性物质提取领域，采用鱼鳞为原料，胃蛋白酶酶解后得到胶原蛋白粗品，通过HPLC优化条件得到合适的流动相和柱分离条件，进一步放大到工业制备级液相色谱分离系统，精制得到高纯度的胶原蛋白。本发明的优点是，粗品使用工业制备级液相色谱分离制备所需物质，可达到较好的分离提纯效果，所需溶剂成本低，操作简单，周期短，效率高，纯度可达99.5%以上。
【专利说明】一种胶原蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种高纯度胶原蛋白的工业方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是结缔组织中极其重要的一种结构蛋白，现已广泛应用于食品、化妆品、营养保健品、生物肥料以及医用材料等领域。它广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中。鱼鳞含有丰富的蛋白质和钙、磷等矿物质，主要由蛋白质和羟基磷灰石组成，其中蛋白质占鱼鳞总重的50%~70%，主要为胶原蛋白和角蛋白，可见鱼鳞是非常好的胶原蛋白生产原料。目前国外对从海洋鱼类鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺已较成熟，其胶原蛋白的提取率达到了 25%~55%，并已运用于工业化生产。而国内有关鱼鳞中提取胶原蛋白的研究还处于起始阶段，刘庆慧等对鱼鳞中提取胶原蛋白进行了初步的研究。而对淡水鱼鱼鳞胶原蛋白的研究，仅有Kimura，S.对鲤鱼鱼鳞的提取及肽链组成进行了研究报道，且仍为采用传统的乙酸作提取剂，提取率不高。尚未实现工业化生产。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于针对目前在制备胶原蛋白过程中所存在的工艺复杂以及纯度不高的问题，提供一种制备高纯度胶原蛋白的新方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
一种胶原蛋白的制备方法，采用鱼鳞为原料，制备型高效液相色谱法制备高纯度胶原蛋白，它包括以下步骤:
(1)将鱼鳞洗净后，在酸性条件下，用胃蛋白酶酶解24h，调至中性，冻干，得胶原蛋白粗·品;
(2)用甲醇溶解胶原蛋白粗品，采用HPLC优化胶原蛋白的最佳分离洗脱条件，将其等比例放大，应用在填充十八烷基反相硅胶填料的动态轴向压缩柱上进行分离，在线收集胶原蛋白对应谱带的馏分；
(3)将步骤(2)中收集的对应谱带洗脱液减压干燥，即可得到色谱纯为99.5%的胶原蛋白。
[0005]本发明的有益效果是选用动态轴向压缩柱来制备胶原蛋白，过程简单、易控制，工艺技术简化，生产成本低，适用于大规模制备。高效液相色谱测定中，总杂质峰小于0.5%，单一杂质峰不超过0.3%。此产品完全符合欧洲药典标准。
【具体实施方式】
[0006]实施例1
1.将鱼鳞洗净后，在酸性条件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，调至中性，冻干，得胶原蛋白粗品；
2.将胶原蛋白粗品注入动态轴向压缩柱制备色谱系统，动态轴向压缩柱尺寸为Φ50X 250mm，十八烷基反相硅胶填料粒径为10 μ m，上样量500mg，流动相流速为80ml/min。分离初期，流动相甲醇与水体积比范围为30/70-85/15，洗脱60min后，流动相甲醇与水的体积比切换为95/5，洗脱至80min，使后端杂质冲洗出来，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为230nm，收集保留时间在43飞Omin的馏分，经HPLC分析纯度≥ 99.6%。
[0007]实施例2
1.将鱼鳞洗净后，在酸性条件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，调至中性，冻干，得胶原蛋白粗品；
2.将胶原蛋白粗品注入动态轴向压缩柱制备色谱系统，动态轴向压缩柱尺寸为Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅胶填料粒径为10 μ m，上样量lg，流动相流速为80ml/min。分离初期，流动相甲醇与水体积比范围为30/70-85/15，洗脱60min后，流动相甲醇与水的体积比切换为95/5，洗脱至80min，使后端杂质冲洗出来，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为230nm，收集保留时间在41.5^52min的馏分，经HPLC分析纯度≥ 99.5%。
[0008]实施例3
1.将鱼鳞洗净后，在酸性条件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，调至中性，冻干，得胶原蛋白粗品；
2.将胶原蛋白粗品注入动态轴向压缩柱制备色谱系统，动态轴向压缩柱尺寸为Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅胶填料粒径为10 μ m，上样量2g，流动相流速为100ml/min。分离初期，流动相甲醇与水体积比范围为40/60-90/10，洗脱60min后，流动相甲醇与水的体积比切换为95/5，洗脱至80min，使后端杂质冲洗出来，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为230nm，收集保留时间在4(T58min的馏分，经HPLC分析纯度≥ 99.5%。
【权利要求】
1.一种胶原蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将鱼鳞洗净后，在酸性条件下，用胃蛋白酶酶解24h，调至中性，冻干，得胶原蛋白粗品; (2)将过滤后的胶原蛋白粗品通过进样泵或者进样阀注入动态轴向压缩制备色谱系统； (3)采用甲醇和水做流动相，梯度洗脱，将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，即可得到高纯度的胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(2)中，在制备色谱系统中，采用动态轴向压缩柱，规格为Φ50Χ250πιπ~Φ150Χ250πιπι，且所填充固定相为十八烷基反相硅胶填料，粒径为10 μ m~45 μ m。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(3)中，梯度洗脱时，流动相甲醇与水的体积比(V/V)范围为3:7~ 9:1。
【文档编号】C12P21/06GK103789380SQ201210426852
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年10月31日 优先权日:2012年10月31日
【发明者】居延娟, 张宇, 王冰冰 申请人:江苏汉邦科技有限公司