专利名称：一种检测AML1-ETO融合基因mRNA表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，具体涉及一种检测AMLl-ETO融合基因mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
急性髓系白血病常见于60岁以下的病人，也可见于大约8%儿童和青少年，通常主要表现为多能干细胞或者已轻度分化的前体细胞核型发生突变。t(8;21)(q22;q22)易位是急性髓系白血病最常见的一种染色体异常，主要见于急性粒细胞白血病部分分化型 (AML-M2)，亦可发生于急性粒细胞白血病未分化型(AML-Ml)、急性粒-单核细胞白血病 (AML-M4)及骨髓增生异常综合征(MDS)-RAEB-T中。其主要特征表现为位于21号染色体 q22 的 AMLl 基因(acute myeloblastic leukemia one gene)与 8 号染色体 q22 的 ETO 基因(eight twenty one gene,也称为MTG8基因)发生融合,从而生成AML1-ET0融合基因。 AMLl-ETO融合基因一方面阻止CBF结合区域的反式激活，从而抑制AMLl的功能；另一方面 ETO与核抑制子异常结合，形成具有组蛋白脱乙酰基酶活性的复合物，进而抑制目标基因的表达，导致髓系前体细胞分化停滞，增殖异常。
AMLl-ETO融合基因阳性是预后好的标志，其完全缓解率可达90%，5年长期无病生存率可达50%_70%，因此，t(8 ；21) (q22 ；q22)的存在是白血病预后良好的标志，美国国立综合癌症网络急性髓系白血病诊疗指南明确指出急性髓系白血病需要进行骨髓或者外周血中AMLl-ETO融合基因的检测，并定期进行监测。大部分病人经化疗或BMT后可在短期内转为阴性，但仍有转阳性的可能，及时治疗可再次转阴性。在老年AML患者中，t(8;21)易位伴随正常核型被认为其预后属于中等；而在AML伴随t (8; 21)易位的高龄患者中异常细胞核型的检测率不到2%，且此类患者完全缓解率可高达87%，但是5年内复发率也可高达84%。 t(8;21)对不同年龄患者的预后存在差别。
AMLl-ETO融合基因mRNA表达的AML患者通过前期诱导加上缓解后的继续治疗能够达到较高的完全缓解率和较长的生存率。因此，AMLl-ETO融合基因表达的检测适应了急性髓系白血病的诊断需要，对其预后的预测具有指导意义。而荧光定量PCR检测AMLl-ETO 融合基因的mRNA水平比应用免疫组化定量检测AMLl-ETO融合蛋白含量其敏感性及特异性均较高。但实时荧光定量PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术与免疫组化法相比有更强的特异性、更高的灵敏度而且检测快速、降低了污染，但目前尚未有用实时荧光定量PCR方法检测急性髓性白血病中AML1-ET0融合基因的相关报道。发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种实时荧光定量RT-PCR方法检测 AML1-ET0融合基因mRNA表达量的试剂盒。
本发明所提供的检测AML1-ET0融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、 荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括AMLl-ETO融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中AMLl-ETO融合基因上游引物如序列表中SEQ ID NO: I所示；AMLl-ETO融合基因下游引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；AMLl-ETO融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；ABL基因上游引物如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物如序列表中SEQ ID NO: 5所示；ABL基因Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列和内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQID NO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。进一步地，所述AMLl-ETO融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA0具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有AMLl-ETO融合基因的总RNA样品。具体地，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/L MgCl24yL, IOX逆转录酶缓冲液2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制剂(RNasin) O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g, AMV 逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ L。具体地，所述荧光定量PCR的混合液(以反应体系终浓度表示)为1Χ的PCR预混合液(原液为 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、
O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及无RNase去离子水。本发明试剂盒的优点和效果如下(I)敏感度高可重复敏感度为O. 01%，即10000个细胞中有一个含AMLl-ETO融合基因就可以被检测出。(2)特异性强使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由弓I物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。(4)全程监控本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小时完成。本发明的试剂盒能快速、准确、定量检测AMLl-ETO融合基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于急性髓性白血病的诊断及治疗过程中微小残留病的监测，为急性髓性白血病的诊断、制定治疗方案及疗效评价和预后提供了重要的检测手段。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图IA是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；图IB是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品的荧光曲线图；图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增
I.OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例I.本发明试剂盒的制备I、特异性的引物和荧光探针的设计根据基因序列(ABL基因序列、AMLl基因序列和ETO基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID为25，核酸参考序列号为NM_005157.4 ;AML1基因ID为861，核酸参考序列号为NM_001001890. 2 ;ΕΤ0基因ID为862，核酸参考序列号为NM_001198625. I)分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分本发明试剂盒组成如下①RNA 提取试剂=Trizol 试剂(Invitrogen 公司，产品货号15596-026/100ml),每Iml骨髓组织加入Iml Trizol试剂快速提取急性髓系白血病患者骨髓组织RNA。②cDNA 第一链合成试剂盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，产品货号K1622):25mmol/LMgCl24 μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制剂(RNasin，一种酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积 11 μ L0③引物、探针和标准品包括AMLl-ETO融合基因引物、内部阳性控制序列引物、内参基因ABL引物以及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下AMLl-ETO融合基因上游引物为5’ -GCCCCGAGAACCTCGAAA-3’(序列表中序列I);AMLl-ETO融合基因下游引物为5’ -TCCACAGGTGAGTCTGGCATT-3’(序列表中序列2)；
AMLl-ETO 融合基因 Taqman 荧光探针FAM 5’ -CGTACTGAGAAGCACTC-3’ TAMRA (序列表中序列3)；内部阳性控制序列为5’ -UGCUGAGCGUGCGACCGCUCUCGUACUGAGCUGCACUCCACGUCCAGCUGUCACUGAGCCG-3，(序列表中序列 7)；内部阳性控制序列上游引物为5’-TGCTGAGCGTGCGACCGCTC-3’(序列表中序列8);内部阳性控制序列下游引物为5’ -CGGCTCAGTGACAGGAC-3’(序列表中序列9)；内部阳性控制序列Taqman 荧光探针为TET 5’-CGTACTGAGCTGCACTC-3’TAMRA (序列表中序列10)。ABL 基因序列为5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL 基因上游引物为5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’(序列表中序列 4)；ABL基因下游引物为5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 荧光探针FAM 5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6);其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的AMLl-ETO融合基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。上述引物序列、控制序列、基因序列和探针序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有AMLl-ETO融合基因的总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例I中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂Trizol试剂(Invitrogen公司，产品货号15596-026/100ml),按每Iml骨髓组织加入ImlTrizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有AMLl-ETO融合基因的急性髓系白血病患者的骨髓组织RNA，作为阳性对照。⑤AMLl-ETO融合基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测AMLl-ETO融合基因的引物、探针组成1X的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2XPCRPremix)、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 AMLl-ETO 融合基因上游引物(序列表中序列1)、0· 25pmol/yL的AMLl-ETO融合基因下游引物(序列表中序列2)、O. 3pmol/ μ L的AMLl-ETO融合基因Taqman突光探针(序列表中序列3)、0· 25pmol/ μ L的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA),其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20 μ L。⑥ABL内参基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/μ L的ABL基因上游引物(序列表中序列4)、O. 25pmol/ μ L的ABL基因下游引物(序列表中序列5)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman突光探针(序列表中序列6)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，加入ABL基因标准品模板2 μ L,其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成ix的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号=210212,
2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8),0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9),0. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，通常取1-2 μ L的模板(内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA)，其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。3、PCR扩增程序的设定在Iightcycler仪器上先经过50°C 10s, 95°C IOmin,然后再经过95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。实施例2.用实施例I制备的试剂盒检测AMLl-ETO mRNA的表达量以检测30例急性髓系白血病骨髓组织标本结果为例。用实施例I提供的本发明的试剂盒检测AMLl-ETO融合基因mRNA表达量的检测流程为首先获取临床急性髓系白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分别制作内部阳性控制序列标准品的标准曲线(如图IA和图IB所示)和ABL标准品的标准曲线(如图2A和图2B所示)，然后再配制AMLl-ETO融合基因荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33 35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算AMLl-ETO融合基因及ABL基因的Ct值，两者之差即为ACt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①急性髓系白血病骨髓组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提急性髓系白血病骨髓组织样品的总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0.1% DEPC处理的水调节抽提的各样品RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA :取2111^上述1 應提取液，在701保温101^11，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24 μ L，IOX逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。取I μ L浓度为2 μ g/ml的内部阳性控制序列RNA (序列表中序列7)，在70°C保温IOmin,随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24y L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150· 5 μ g和AMV逆转录酶I. 5U，补加无RNase去离子水至总体积20 μ L，于42°C保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA。反应结束后,加热至99°C, 5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。取I μ L浓度为2 μ g/ml的阳性对照RNA，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24yL,10X逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱-20°C保存。③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用实施例I提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图IA和图IB所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示)。④AML1-ET0融合基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20yL:含IXPCR预混合液(Qiagen 公司，产品货号210212, 2 X PCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG酶，AMLI-ETO融合基因引物终浓度0. 2 μ mo I /L，AMLI-ETO融合基因Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L,被测样品RNA反转录合成的cDNA l.OyL,同时加入终浓度为0. 2 μ mo I/L的内部阳性控制序列的引物、终浓度为0. 3 μ mol/L的内部阳性控制序列的探针和终浓度为0. 2 μ mol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA (②中反转录合成的cDNA)，加入超纯水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因引物终浓度0. 2 μ mol/L,探针终浓度0. 2 μ mol/L, ABL基因cDNA l.OyL,加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，AML 1-ΕΤ0融合基因引物终浓度0. 2 μ mol/L,探针终浓度0. 3 μ mol/L,阳性对照RNA反转录合成的cDNAl. 0μ L或者阴性对照去离子水I. O μ L，加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑦数据收集处理和分析PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出AMLl-ETO融合基因相对于ABL基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于
O.0001为阳性表达，小于O. 0001为阴性表达(具体参见表I)表I荧光定量PCR分析融合基因AMLl-ETO在急性髓系白血病中的表达
权利要求
1.一种检测AMLl-ETO融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括AMLl-ETO融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中 AMLl-ETO融合基因上游引物如序列表中SEQ ID NO: I所示； AMLl-ETO融合基因下游引物如序列表中SEQ ID N0:2所示； AMLl-ETO融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示； ABL基因上游引物如序列表中SEQ ID N0:4所示； ABL基因下游引物如序列表中SEQ ID N0:5所示； ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID N0:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ IDNO: 10所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述AMLl-ETO融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有AMLl-ETO融合基因的总RNA样品。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/LMgCl24y L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ 1，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ L。
7.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为1X的PCR 预混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和无RNase去离子水。
全文摘要
本发明涉及一种检测AML1-ETO融合基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括AML1-ETO融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。AML1-ETO融合基因是急性髓系白血病最常见易位之一，其与CBFβ作用，干扰AML1介导的髓系特异性基因的正常表达。采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测AML1-ETO融合基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。本发明试剂盒为预测急性髓系白血病的预后以及化疗方案的确定提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
文档编号C12Q1/68GK102925573SQ20121044110
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年9月29日
发明者李艳, 童永清 申请人:李艳, 童永清