专利名称：检测水稻粒型的分子标记方法、试剂盒和引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，特别涉及检测水稻粒型基因的分子标记标记方法、试剂盒和引物。
背景技术：
水稻谷粒内、外稃的两缘相互勾合包被着糙米，在籽粒形成中起着重要的作用，一方面合成同化物，另一方面对籽粒进行塑型，影响稻米粒型、灌浆充实度和千粒重等。通过从水稻花发育突变体中分离克隆到相关的基因，以及利用已克隆的植物花发育基因的保守序列为探针从水稻基因组文库和CDNA文库筛选分离到与水稻花发育有关的A、B、C、D、E类基因。依据花器官突变体表型与相关基因的关系总结出调控单子叶植物花形态建成遗传控制的AB⑶E模型假说。发明内容
为了能检测出水稻粒型性状的基因型，本发明的第一个目的是提供用于检测水稻粒型的特异性分子标记，本发明的第二个目的是提供采用上述的特异性分子标记检测水稻粒型的分子标记方法，本发明的第三个目的是提供采用上述的特异性分子标记检测水稻粒型的分子标记试剂盒。采用上述的特异性分子标记检测水稻植株粒型性状的基因型，具有准确性高，操作简单的特点。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案用于检测水稻粒型的特异性分子标记，该特异性分子标记具有正向引物和反向引物， 正向引物自5'端至:V端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5' 端至3'端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案 检测水稻粒型的分子标记方法，该方法按以下步骤进行提取水稻DNA，采用Caps分子标记mg进行PCR扩增，Caps分子标记mg包括正向引物和反向引物，正向引物自5'端至 3'端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自Y端至3'端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG，将PCR产物用Bsrh I酶切后，电泳检测1)检测水稻粒型性状显性纯合基因的特异性酶切片段分别为309bp和488bp；2)检测水稻粒型性状隐性纯合基因的特异性酶切片段分别为63bp，241bp，488bp；3)检测水稻粒型性状杂合基因的特异性酶切片段分别为63bp，241bp，309bp，488bp。
作为优选，上述提取水稻DNA的方法包括以下步骤1)取新鲜水稻叶片3-5cm放入2.OmL离心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2)加入500 μ I 的 TPS 抽提液，TPS 抽提液包括 IOOmM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH8. O, IM KCl，灭菌后备用，65°C空气浴中放置lh，每隔30min颠倒混匀离心管中的沉淀；3)12000rpm离心15min，移上清液约350μ L于新离心管中，加入等体积的异丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 离心 IOmin ；4)弃上清液,再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm离心5min ；5)弃上清液，室温下白色的DNA沉淀风干后溶解于100μ L灭菌ddH20，-20°C保存备用。
作为优选，上述的PCR反应体系如下DNA模板I μ I2.5mM dNTPs 5 μ I 10XK0D buffer 12. 5μ I ΙΟμΜ正向引物 Ιμ ΙΟμΜ反向引物 Ιμ IU/ μ I KOD SI O. 5 μ I H2O4 μ Io
作为优选，上述的PCR反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性60sec，65°C退火 60sec，72°C延伸120sec，共34个循环;最后72°C延伸IOmin0
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案检测水稻粒型的分子标记试剂盒，该试剂盒包括Caps分子标记mg, Caps分子标记mg包括正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5 '端至3 '端的核苷酸序列为 TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
本发明由于采用了上述的技术方案，只采取一次PCR和酶切就能检测出粒型性状的基因型，提高了检测效率，具有准确性高，操作简单的特点。
图1为特异性分子标记mg对“93-11/浙粳月亮型”杂交后F2分离群体的PCR扩增结果。图2为PCR产物用没srb I酶切结果。图中，M代表标记(Marker)，93-ll代表水稻品种93-11 ；G代表浙粳月亮型P1代表“93-11/浙粳月亮型”的杂种F1植株；F2代表“93-11/ 浙粳月亮型”的F2植株。
具体实施方式
实施例1用于检测水稻粒型的特异性分子标记，该特异性分子标记具有正向引物和反向引物， 正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5' 端至3'端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
实施例2本发明涉及浙粳月亮型粒型，保藏号CGMCC No. 5554，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏时间为2011年12月31日；分类命名水稻(Orjza saiira );性状稳定。发明人在研究中将浙粳月亮型颖壳与籼稻品种93-11 (国家水稻中期库保存号CN20483)配组，构建群体， 分析各个株系的基因型。在种植上述93-11与浙粳月亮型颖壳杂交后的F2群体，苗期采用特异性分子标记mg进行水稻粒型基因的检测。
一、DNA 提取1.取新鲜水稻叶片3-5cm放入2.OmL离心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2.加入500 μ I 的 TPS 抽提液(IOOmM Tris-HCl，IOmM EDTA, ρΗ8· O, IM KCl，灭菌后备用)，65°C空气浴中放置lh，每隔30min颠倒混匀离心管中的沉淀；3.12000rpm离心15min，移上清液约350 μ L于新离心管中，加入等体积的异丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 离心 IOmin ；4.弃上清液，再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm离心5min ；5.弃上清液，室温下白色的DNA沉淀风干后溶解于100μ L灭菌ddH20，-20°C保存备用。
二、PCR 扩增PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
I PCR反应体系(25 μ I)如下DNA模板I μ IdNTPs (2. 5mM) 5 μ I10XK0D buffer 12. 5μ I mg (正向引物，10 μ Μ) 1μ Img (反向引物，10 μ Μ) I μ IKOD酶(东洋纺公司，IU/ μ I) O. 5 μ IH2O 4 μ I2. PCR反应条件引物mg温度反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性60sec，65°C退火60sec，72°C延伸120sec，共34个循环；最后72°C延伸IOmin0
三、PCR反应产物检测将扩增产物，经溴化乙锭染色后上样在1%琼脂糖凝胶上，电泳，在UVP凝胶成像仪上成像。
在F2分离群体中存在两种表型的植株，从月亮型粒型表型植株中收获的种子，只有一种隐性纯合的月亮型突变表型植株(aa基因型)，后代不发生分离，都出现突变表型； 从正常表型植株中收获的种子，有两种基因型。一种是显性纯合的正常表型植株(AA基因型)，后代不发生分离，都出现正常表型；另一种是杂合的植株(Aa基因型)，虽然当代表现为正常表型，但后代发生分离，出现正常和月亮型粒型两种表型。
分别对F2分离群体中两种表型的植株进行检测，用标记mg扩增后的PCR产物大小为797bp，将PCR产物用Bsrh I酶切后，根据酶切条带大小可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型1)检测水稻粒型性状显性纯合基因的特异性酶切片段分别为309bp和488bp；2)检测水稻粒型性状隐性纯合基因的特异性酶切片段分别为63bp，241bp，488bp；3)检测水稻粒型性状杂合基因的特异性酶切片段分别为63bp，241bp，309bp，488bp。
如图1所示，F2分离群体用标记mg扩增后PCR产物大小无差异。将PCR产物用 Bsrb I酶切后，结果如图2所示，泳道3酶切片段与93-11 —致，说明这一植株的基因型为 AA ;泳道1、2、4、5、6、8、9、10、11、12酶切片段与G —致，这些植株的基因型均为aa ;泳道7 与F1—致，说明这些植株的基因型为Aa。与实际相符。这说明，利用分子标记mg能够准确检测水稻植株的粒型基因 型。序列表〈110〉浙江省农业科学院〈120〉检测水稻粒型的分子标记方法、试剂盒和弓I物 <160>2<210>1 〈211〉 25 〈212〉引物 〈213〉人工合成 〈400〉 IAAGAACTCAC GGGATGATGA ACTGC 25<210>2 〈211〉 25 〈212〉引 物 〈213〉人工合成 〈400〉 2TCTTGTGATT CAGGTTGCAT TACGG 2权利要求
1.检测水稻粒型的分子标记方法，其特征在于该方法按以下步骤进行提取水稻DNA，采用Caps分子标记mg进行PCR扩增,Caps分子标记mg包括正向引物和反向引物,正向引物自5'端至3,端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3,端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGGJf PCR产物用Bsrh I酶切后，电泳检测 1)检测水稻粒型性状显性纯合基因的特异性酶切片段分别为309bp和488bp； 2)检测水稻粒型性状隐性纯合基因的特异性酶切片段分别为63bp，241bp，488bp； 3)检测水稻粒型性状杂合基因的特异性酶切片段分别为63bp，241bp，309bp，488bp。
2.根据权利要求1所述的检测水稻粒型的分子标记方法，其特征在于提取水稻DNA的方法包括以下的步骤 1)取新鲜水稻叶片3-5cm放入2.OmL离心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2)加入500 ill 的 TPS 抽提液，TPS 抽提液包括 IOOmM Tris-HCl, IOmM EDTA, pH8. 0, IMKCl，灭菌后备用，65°C空气浴中放置lh，每隔30min颠倒混匀离心管中的沉淀； 3)12000rpm离心15min，移上清液约350y L于新离心管中，加入等体积的异丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 离心 IOmin ； 4)弃上清液,再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm离心5min ； 5)弃上清液，室温下白色的DNA沉淀风干后溶解于IOOiiL灭菌ddH20，-20°C保存备用。
3.根据权利要求1所述的检测水稻粒型的分子标记方法，其特征在于PCR反应体系如下 DNA模板I u I 2.5mM dNTPs 5 U IIOXKOD buffer 12. 5u I IOiiM正向引物 IiU IOiiM反向引物 IiU IU/ul KOD SI 0. 5u I H2O4u I0
4.根据权利要求3所述的检测水稻粒型的分子标记方法，其特征在于PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性60sec，65°C退火60sec，72°C延伸120sec，共34个循环；最后72°C延伸 lOmin。
5.检测水稻粒型的分子标记试剂盒，其特征在于该试剂盒包括Caps分子标记mg,Caps分子标记mg包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3'端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
6.用于检测水稻粒型的特异性分子标记，该特异性分子标记具有正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3'端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
全文摘要
本发明涉及水稻品种资源特性的检测技术，特别涉及检测水稻粒型基因的分子标记标记方法、试剂盒和引物。用于检测水稻粒型的特异性分子标记，该特异性分子标记具有正向引物和反向引物，正向引物自5′端至3′端的核苷酸序列为AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5′端至3′端的核苷酸序列为TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。本发明只采取一次PCR和酶切就能检测出粒型性状的基因型，提高了检测效率，具有准确性高，操作简单的特点。
文档编号C12Q1/68GK102994635SQ20121044324
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年6月21日
发明者张小明, 周崖, 叶胜海, 金庆生, 吴庆 申请人:浙江省农业科学院