快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法
【专利摘要】本发明涉及快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，其主要步骤包括：(1)、血样经植物凝血素处理后置于37℃恒温培养箱内静置45-90分钟；(2)、将植物血凝素处理后的血样中淋巴细胞置于含有秋水仙素、ATP、5％胎牛血清、CalyculinA以及CDK1/CyclinB的混合培养液中37℃培养3-12小时；(3)、细胞混合培养后，使用0.075mol?KCl低渗10-20分钟；(4)、向含有低渗处理细胞的低渗液中加入固定液预固定1次，再加入固定液固定2次，每次固定10-15分钟，最后将细胞悬于固定液中。本发明与常规早熟凝集染色体制备方法相比，大大缩短了时间，仅需要3-12小时。
【专利说明】快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞遗传学领域，具体涉及人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的制备方法。
【背景技术】
[0002]早熟凝集染色体(Premature Condensed Chromosome, PCC)最经典的概念是指将处于分裂期(M期)的细胞与处于细胞周期其他阶段的细胞融合，其他期细胞的染色质提早包装成染色体。由于G1、S、G2的DNA复制状态不同，早熟凝集的染色体的形态各异，如与M期细胞融合的Gl期的染色体为单线状，S期为粉末状，G2期染色体为双线。
[0003]早熟凝集染色体PCC作为辐射剂量估算的方法，受到了广泛的关注和认可。早熟凝集染色体比常规染色体法具有很强的优势:①可诱导静止期细胞的分裂，可大大增加分析细胞的数量，避免了常规染色体畸变分析中只对分裂期细胞进行选择性分析的不足；②得出的染色体损伤为原始损伤，有利于观察到局部照射或“旁效应”辐射能量在细胞内的直接或间接沉积，增加了适用的剂量评估范围，提高了方法的敏感性和结果的准确性；?PCC操作简便、省时，而常规染色体分析需要丰富的经验和熟练的技巧，且给出剂量的时间需4-5d，对大批伤员不能及时提供剂量估算。因此使用PCC用于估算受照人员的辐射剂量，在大剂量的辐射事故中，可以提供足够的可供分析的染色体。④PCC还有其它优势，比如与受照剂量有严格的定量关系，以及用离体实验建立的剂量效应刻度曲线与整体实验所得到的剂量效应曲线无显著性差异(Gotoh E, Tanno Y, Takakura K.Simple biodosimetry methodfor use in cases ofhigh—dose radiation exposure that scores the chromosomenumber ofGiemsa-stained drug-1nduced prematurely condensed chromosomes (PCC).1nt J Radiat Biol.2005，81(I):33-40.)。
[0004]但是早期的细胞融合 方法制备PCC细胞费时、技术要求高、PCC产额低、不稳定等限制了它作为生物剂量计的应用。最近，一些具有促进细胞分裂作用物质的发现和应用，取代了过去传统PCC中的细胞融合技术，使制备PCC对技术的要求大为降低，缩短了分析时间，如冈田酸(okadaicacid)和花萼海绵诱癌素A(calyculin A)。冈田酸可使外周血淋巴细胞在Gl、G2和M期发生PCC，但是，诱导PCC过程中的淋巴细胞培养阶段都需要至少48小时。calyculin A可诱导任一时相的细胞发生PCC，大大提高了可用于分析细胞的数目(Prasanna PG, Escalada ND, Blakely WF.1nduction of premature chromosomecondensation by a phosphataseinhibitor and a protein kinase in unstimulatedhuman peripheralblood lymphocytes:a simple and rapid technique to studychromosomeaberrations using specific whoIe-chromosome DNA hybrid.Mutat Res,2000,466(2):131-41.)，但诱导PCC过程中的淋巴细胞培养阶段时间仍需大约48小时。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于建立快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，以解决现有技术制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体耗时长的问题。
[0006]本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现:
[0007]快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，包括如下步骤:
[0008](I)、植物凝血素处理(PHA):采集3_5ml血样，向血样中加入植物凝血素至终浓度80-120 μ g/ml，混匀后置于37°C恒温培养箱内静置45-90分钟；
[0009](2)、混合培养:将植物血凝素处理后的血样离心，取中层分界处的淋巴细胞，置于含有 250μ g/ml 秋水仙素、10mmol/L ATP、5 % 胎牛血清、500nmol/L CalyculinA 以及
0.2mg/ml CDKl/CyclinB的混合培养液中，混匀后置于37°C恒温培养箱内静置培养3_12小时；
[0010](3)、细胞低渗处理:细胞混合培养后，离心弃上清，使用0.075molKC13-5ml低渗10-20分钟；
[0011](4)、细胞固定:向含有低渗处理细胞的低渗液中加入0.5-lml固定液预固定，混匀后立即离心弃上清，再加入4-6ml固定液固定2次，每次固定10-15分钟后离心弃上清，最后将细胞悬于0.5-lml固定液中；其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3: I配制。
[0012]其中，步骤⑵所述离心采用300_400rpm离心3-5分钟；步骤⑶所述离心采用800-1000rpm离心8-10分钟；步骤(4)所述离心米用800-1000rpm离心8-10分钟。
[0013]本发明建立的快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，其优点在于制备PCC耗时短，其中人外周血淋巴细胞植物血凝素(PHA)处理后混合培养过程仅需3-12小时，比现有技术制备PCC过程中`的淋巴细胞培养时间(大约48小时)明显缩短，从而为PCC的制备提供了快速途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为淋巴细胞经混合培养3小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。
[0015]图2为淋巴细胞经混合培养6小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。
[0016]图3为淋巴细胞经混合培养12小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。
【具体实施方式】
[0017]以下通过实施例详细描述本发明提供的快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法。下面实施例中所涉及的生物技术没有特别描述之处均采用细胞遗传学常规技术，如《分子克隆实验指南》中提供的常规技术方法。
[0018]实施例1:
[0019](I)、采集正常志愿者血样3ml，向血样中加入PHA(广州市医药工业研究所)至终浓度80 μ g/ml,混匀后置于含5% CO2的37°C恒温培养箱内静置I小时；
[0020](2)、血样在上述37 °C恒温培养箱内静置I小时后，经300rpm离心3分钟，取
0.5ml中层分界处血淋巴细胞,置于含有3ml 250 μ g/ml秋水仙素(sigma公司)、10mmol/LATP(sigma 公司)、5%胎牛血清、500nmolCalyculinA(sigma 公司)以及 0.2mg/ml 的 CDKl/CyclinB (细胞周期素依赖性激酶I/细胞周期素B，Invitrogen公司)混合培养液中，混匀后置于37°C恒温培养箱内静置3小时；
[0021](3)、淋巴细胞经混合培养3小时后1000rpm离心10分钟，加入5ml的0.075molKCl低渗液在含5% CO2的37 °C条件下低渗20分钟；
[0022](4)、向含有低渗处理淋巴细胞的低渗液中加入0.5ml固定液预固定，混匀后立即1000rpm离心10分钟弃上清，再加入5ml固定液固定2次,每次固定15分钟后1000rpm离心10分钟弃上清，最后将细胞悬于Iml固定液中；其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3: I配制。
[0023]在95°C温度下于热蒸汽上烘干制片，经空气干燥后用5%姬姆萨染色，显微镜观察PCC指数和形态，图1为淋巴细胞经混合培养3小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。
[0024]实施例2:
[0025](I)、采集正常志愿者血样3ml，向血样中加入PHA(广州市医药工业研究所)至终浓度100 μ g/ml,混匀后置于含5% CO2的37°C恒温培养箱内静置I小时；
[0026](2)血样在上述37°C恒温培养箱内静置I小时后，经400rpm离心3分钟后，取
0.8ml中层分界处淋巴细胞，置于含有3ml 250 μ g/ml秋水仙素、10mmol/L ATP、5%胎牛血清、500nmol CalyculinA以及0.2mg/mlCDKl/CyclinB混合培养液中，混匀后置于37°C恒温培养箱内静置6小时；
[0027](3)淋巴细胞经混合培养6小时后1000rpm离心10分钟，加入5ml的0.075molKCl低渗液在含5% CO2的37 °C条件下低渗20分钟；
[0028](4)、向含有低渗 处理淋巴细胞的低渗液中加入0.8ml固定液预固定，混匀后立即1000rpm离心10分钟弃上清，再加入5ml固定液固定2次,每次固定10分钟后1000rpm离心10分钟弃上清，最后将细胞悬于0.5ml固定液中；其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3:1配制。
[0029]在95°C温度下于热蒸汽上烘干制片，经空气干燥后用5%姬姆萨染色，显微镜观察PCC指数和形态，图2为淋巴细胞经混合培养6小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。
[0030]实施例3:
[0031](I)采集正常志愿者血样5ml，向血样中加入PHA(广州市医药工业研究所)至终浓度100 μ g/ml，混匀后置于含5% CO2的37°C恒温培养箱内静置90分钟；
[0032](2)血样在上述37 °C恒温培养箱内静置90分钟后，300rpm离心3分钟，取0.5ml中层分界处淋巴细胞，置于含有3ml 250μ8/πι1秋水仙素、lOmmol/L ATP、5%胎牛血清、500nmol CalyculinA以及0.2mg/mlO)Kl/CyclinB混合培养液中，混匀后置于37°C恒温培养箱内静置12小时；
[0033](3)淋巴细胞经混合培养12小时后800rpm离心10分钟，加入4ml的0.075molKCl低渗液在含5% CO2的37 °C条件下低渗20分钟；
[0034](4)、向含有低渗处理淋巴细胞的低渗液中加入Iml固定液预固定，混匀后立即800rpm离心10分钟弃上清,再加入5ml固定液固定2次,每次固定10分钟后800rpm离心10分钟弃上清，最后将细胞悬于0.5ml固定液中；其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为
3: I配制。
[0035]在95°C温度下于热蒸汽上烘干制片，经空气干燥后用5%姬姆萨染色，显微镜观察PCC指数和形态，图3为淋巴细胞经混合培养12小时后早熟凝集染色体M期分裂相图。
【权利要求】
1.快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，其特征包括如下步骤: (1)、植物凝血素处理:采集3-5ml血样，向血样中加入植物凝血素至终浓度80-120 μ g/ml，混匀后置于37°C恒温培养箱内静置45-90分钟； (2)、混合培养:将植物血凝素处理后的血样离心，取中层分界处的淋巴细胞，置于含有250 μ g/ml 秋水仙素、10mmol/L ATP、5%胎牛血清、500nmol/L CalyculinA 以及 0.2mg/ml⑶K/CyclinB的混合培养液中，混匀后置于37°C恒温培养箱内静置培养3_12小时； (3)、细胞低渗处理:细胞混合培养后，离心弃上清，使用0.075molKC13-5ml低渗10-20分钟； (4)、细胞固定:向含有低渗处理细胞的低渗液中加入0.5-lml固定液预固定，混匀后立即离心弃上清，再加入4-6ml固定液固定2次，每次固定10-15分钟后离心弃上清，最后将细胞悬于0.5-lml固定液中；其中固定液是甲醇与冰醋酸按体积比为3: I配制。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述离心具体为:300-400rpm离心3-5分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述离心具体为:800-1000rpm尚心8-10分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述离心具体为:800-1000rpm尚心8-10分钟。
【文档编号】C12N5/0783GK103805564SQ201210444240
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】刘青杰, 高玲, 陆雪, 陈德清 申请人:中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所