专利名称：提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程技术提高啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
4-乙烯基愈创木酚感官阈值很低，仅为O. 3mg/L,即使痕量，也能使啤酒呈现药房味、酚味、丁香味或烟熏味，因而在大多数下面发酵啤酒中，其风味并不受欢迎，并且被称作是“酹异味(phenolic off-flavour)”。尽管对下面发酵啤酒而言是异味物质,但是众所周知，4-乙烯基愈创木酚却是形成比利时白啤酒(用未发芽的小麦酿造)、德国小麦啤酒(用小 麦芽酿制)以及烟熏啤酒等上面发酵啤酒的必不可少的香味物质，也是该类啤酒全面风味评价不可或缺的特色成分。在啤酒酿造过程中，通过水解和酶解作用，许多酚酸会游离出来，在上面发酵啤酒酵母中酚酸脱羧酶的作用下，可以将其中的酚酸脱羧，形成4-乙烯基愈创木酚(呈丁香花味)等特色风味物质，可以显著地提高上面发酵小麦啤酒的香味。目前4-乙烯基愈创木酚主要是通过化学或生物法进行合成。如中国专利文献CN101885669A (申请号201010229531. X)公开了一种4-乙烯基愈创木酚的制备方法，步骤为(1)向反应器中依次投入喹啉、阿魏酸和作为阻聚剂的对苯二酚，打开加热装置，接通氮气保护装置，到体系无气体溢出停止加热，继续搅拌40-60分钟；(2)将上述反应中加入溶剂苯中搅拌均匀，并向该溶液中加入盐酸，搅拌均匀，然后静置分层，检测水相pH值为中性为止；最后向去离子水洗后的溶液中加入干燥剂无水氯化钙；(3)将干燥后的溶液放入蒸馏器中，在常压下将作为溶剂的苯蒸出，然后连接上真空泵在100°C以下的气相温度下将产品蒸出即可。由于该方法产生部分副产物及原料残留，无法直接添加到啤酒酿造过程中。中国专利文献CN101397568A (申请号200810233517. X)公开了一种通过基因克隆的方法获得ENTEROBACTER SP. PX6-4中分解阿魏酸生成4-乙烯基愈创木酚的关键酶阿魏酸脱羧酶的编码区序列、并通过异源表达技术在大肠杆菌(E. COLI BL21)中大量表达了该酶；通过纯化的方法获得了阿魏酸脱羧酶的纯品；运用悬滴结晶法得到阿魏酸脱羧酶的蛋白质结晶，并且掌握了该酶的结构及活性中心。由于阿魏酸是4-乙烯基愈创木酚的前体物质，在啤酒酿造过程中添加阿魏酸脱羧酶，虽然能够提高啤酒中的4-乙烯基愈创木酚含量，但效果无法满足实际需求。事实上，部分细菌和真菌含有PADC基因，编码酚酸脱羧酶(phenolic aciddecarboxylase),在生物的降解代谢过程中起着非常重要的作用，例如不动杆菌Acinetobacter、突光假单胞菌 Pseudomonasfluorescens 和枯草芽抱杆菌 Bacillussubtilis等，但PADC基因应用于啤酒酿造工艺中尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用基因工程技术提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法。一种提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，步骤如下(I)从枯草芽孢杆菌中通过PCR扩增PADC基因，PADC基因核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，PCR扩增引物序列如下上游引物F-padc5，~GCGTCTAGAATGGAAAACTTTATCG~3，下游引物R-padc5’~GCGAAGCTTTTATAATCTTCCCGC~3，；(2)将步骤(I)制得的PADC基因经纯化后，经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切后与同样经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切的质粒YEp352连接，制得重组质粒YPADC，将重组质粒YPADC转化至上面发酵酵母W303-1A，获得上面发酵重组酵母菌株W303+padc ；·
(3)利用11° P麦汁对步骤(2)制得的上面发酵重组酵母菌株W303+padc进行扩大培养，培养条件为25 28°C摇床，220 240r/min，获得上面发酵酵母W303+padc ；(4)将步骤(3)制得的上面发酵酵母W303+padc接种于11° P麦汁中，在温度为16 18°C进行发酵培养至糖度为4° P时，密封发酵容器保压至双乙酰含量低于O. lmg/L,降温至O 2°C，保存5 8天，制得4-乙烯基愈创木酚含量为I. 6 I. 8mg/L的啤酒。根据本发明优选的，所述步骤(I)中，PCR反应程序为94°C预变性3min ;94°C模板变性30s，52. 6°C引物退火30s，72°C引物延伸45s, 30个循环；72°C延伸IOmin0根据本发明优选的，所述步骤(2 )中，重组质粒YPADC转化上面发酵酵母W303-1A采用醋酸锂转化法。根据本发明优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中的11° P麦汁的制备方法如下大麦芽和小麦芽按重量比3 2混合后，以EBC标准磨进行粉碎，采用浸出糖化法经糖化后，经过滤、煮沸后，制得11° P麦汁。根据本发明进一步优选的，上述糖化的具体步骤为投料温度为37°C，保持20min ;升温至45°C保持30min，然后升温至52°C保持40min ;再升温至65°C，保持70min ；最后升温至78°C浸出即可。有益效果本发明首次通过对上面发酵酵母进行基因工程改造获得具有特殊功能的啤酒酵母，并将该酵母用于啤酒酿造，从而显著提高了上面发酵小麦啤酒中的4-乙烯基愈创木酚含量，突出了上面发酵小麦典型的丁香花味。该方法为改善啤酒口味和香味提供了新的方法，为基因工程应用于啤酒酿造领域奠定了基础。
图I为PCR获得的PADC基因的电泳图；其中M为 D2000DNA Marker, 1、2、3、4、5、6、7 为 PADC 基因；图2为质粒YEp352与PADC基因PCR纯化产物的双酶切电泳图；其中A为Ikb DNA Maker，B为 YEp352质粒，C为PADC PCR纯化产物，D为D2000DNAMaker ；图3为重组质粒YPADC的构建过程示意图；图4为重组质粒YPADC的酶切鉴定电泳其中M为Ikb DNAMarker, I为XbaI和HindIII双酶切重组质粒YPADC，2为重组质粒YPADC，3为XbaI和HindIII双酶切质粒YEp352，4为XbaI和HindIII双酶切PADC基因，5 为 D2000DNAMarker ；图5为克隆菌株W303+padc的菌落PCR验证电泳图；其中M-D2000DNAMarker，I 为出发菌株 W303-1A，2 21 为克隆菌株 W303+padc ；图6为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc的SDS-PAGE电泳图；其中M为marker，I为出发菌株W303-1A，2为克隆菌株W303+padc ；图7为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酶活性的柱状对比示意图；
图8为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酿造的啤酒的外观浓度和双乙酰含量变化曲线图；图9为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酿造的啤酒的4_乙烯基愈创木酚含量柱状对比示意图；图10为出发菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酿造啤酒的感官品评示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。生物材料来源枯草芽孢杆菌购自上海勒布生物科技有限公司，商品编号为ACCC10627 ；上面发酵啤酒酵母W303-1A购自德国Doemens啤酒学院；内切酶XbaI,内切酶HindIII,质粒YEp352购自Fermentas公司；培养基枯草芽孢杆菌培养基鹿糖30. 0g、磷酸二氢钾4. 5g、硫酸铵2. 5g、蛋白胨10g、碳酸|丐2g、酵母膏5g和琼脂20g，然后在IOOOmL水中充分溶解，再121°C高压灭菌。大肠杆菌E. coli DH5 α培养基LB 酵母提取物58,胰蛋白胨1(^,似(^1(^,溶于9501]11^蒸懼水中，用51 NaOH调pH至7. 0，加蒸馏水定容至IOOOmL (如果配制固体培养基，还需加I. 5wt%的琼脂)，分装，121°C高压灭菌20min。酵母菌培养基YPD (IL):酵母提取物IOg,胰蛋白胨20g,溶于950mL蒸懼水中(如果配制固体培养基，还需加1.5被％的琼脂)，？!1自然，121°C高压灭菌20min后，冷却到55°C，然后加入115°C单独灭菌30min的葡萄糖溶液，使葡萄糖终浓度为2wt%，蒸馏水定容至1L。SC固体平板培养基(IL):无氨基酸的酵母氮源(YNB) 6. 7g，腺嘌呤50mg，尿嘧啶50mg,组氨酸IOOmg,色氨酸IOOmg,亮氨酸IOOmg,精氨酸20mg,天冬氨酸IOOmg,谷氨酸IOOmg,异亮氨酸30mg,赖氨酸30mg,甲硫氨酸20mg,苯丙氨酸50mg,丝氨酸150mg,苏氨酸150mg,酪氨酸30mg,纟颜氨酸150mg,调节pH值为6. 5,加入I. 5%的琼脂,再加入40wt%葡萄糖使之终浓度为2wt%，蒸馏水定容至1L，在121°C下灭菌15min。SCTffa固体平板培养基为省略尿嘧啶的SC固体平板培养基。
设备EBC标准磨购自德国Biihler公司；LB8全自动糖化仪购自Lochner公司；实施例I.枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis DNA的提取挑取枯草芽孢杆菌，接种于枯草芽孢杆菌培养基，36°C震荡过夜培养。取IOOmL菌液，5000r/min离心lOmin，弃上清液；菌体沉淀用IOmL TE缓冲液(Tris- EDTA缓冲液)悬浮，加O. 5mL10wt%十二烷基硫酸钠，50 μ L蛋白酶K，混匀，37°C保温Ih0加I. 5mL5mol/LNaCl，混匀。力卩 I. 5mL CTAB/NaCl 溶液(NaCll. 4M, CTAB2%, Tris · CllOOmM, EDTA20mM，巯基 乙醇O. 2%)，混匀，65°C保温20min。用等体积抽提液I抽提，抽提液I按酚氯仿异戊醇的体积比为25:24:1混合,5000r/min离心IOmin,移取上清液至干净离心管,用等体积抽提液II抽提，抽提液II按氯仿异戊醇的体积比为24:1混合，取上清液移至干净管中。加I倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置lOmin，10000r/min离心15min得到DNA沉淀。加Λ 700 μ I体积浓度为70%的乙醇，70 μ 13mol/LNaAc漂洗DNA沉淀，溶解于ImL TE缓冲液，-20°C保存。去除RNA :加5 μ LRNase,加1/10体积3mol/LNaAc,加2倍体积无水乙醇IOmin后，将DNA沉淀溶于ImL TE，_20°C保存，制得枯草芽孢杆菌DNA。2.弓丨物设计及PADC基因片段的克隆上游引物F-padc5，~GCGTCTAGAATGGAAAACTTTATCG~3，SEQIDN02下游引物R-padc5，~GCGAAGCTTTTATAATCTTCCCGC~3，SEQIDNO.3上游引物5’端引入XbaI酶切位点(下划线部分)，下游引物5’端引入HindIII酶切位点(下划线部分)，由Invitrogen公司合成。以F-padc和R-padc为引物，枯草芽孢杆菌DNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)，反应体系为50 μ L，具体如下
F-padcI μL
R-padc丨
dNTPs4 nL
Easy Taq I Οχ buffer5 μ
IkiciIIiis subtilis DNA I ,uLddH2037 .uL
Easy Taq DNA Polymerase I μ LPCR 反应程序为94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，52. 6°C退火 30s，72°C延伸 45s，30个循环；72°C延伸IOmin。经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图I所示，由图I可以看出，扩增出了 I条约504bp的特异性片段，符合预期PADC基因片段的大小504bp。3. PCR产物的纯化取PCR 产物 200 μ L 和 6xLoading Buffer40 μ L,以及 5 μ L D2000DNA Marker 上样，跑I. 5%琼脂糖凝胶电泳。然后，用上海捷瑞生物工程有限公司GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物的纯化。
4. PCR产物的酶切和连接以限制性内切酶XbaI和HindIII分别将纯化的PADCPCR产物和质粒YEp352进行酶切，如图2所示，反应体系分别为30 μ L和20 μ L0反应混合物要依次加入，轻轻弹击混合均匀，离心机离心5秒钟。放37°C水浴。
权利要求
1.一种提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，其特征在于，步骤如下 Cl)从枯草芽孢杆菌中通过PCR扩增PADC基因，PADC基因核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，PCR扩增引物序列如下 上游引物F-padc5’ -GCG TCTAGA ATGGAAAACTTTATCG-3’ 下游引物R_padc5’ -GCG AAGCTT TTATAATCTTCCCGC-3’ ； (2)将步骤(I)制得的PADC基因经纯化后，经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切后与同样经内切酶XbaI和内切酶HindIII双酶切的质粒YEp352连接，制得重组质粒YPADC，将重组质粒YPADC转化至上面发酵酵母W303-1A，获得上面发酵重组酵母菌株W303+padc ； (3)利用11°P麦汁对步骤(2)制得的上面发酵重组酵母菌株W303+padc进行扩大培养，培养条件为25 28°C摇床，220 240r/min，获得上面发酵酵母W303+padc ； (4)将步骤(3)制得的上面发酵酵母W303+padc接种于11°P麦汁中，在温度为16 18°C进行发酵培养至糖度为4° P时，密封发酵容器保压至双乙酰含量低于O. lmg/L，降温至O 2°C，保存5 8天，制得4-乙烯基愈创木酚含量为I. 6 I. 8mg/L的啤酒。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I冲，PCR反应程序为94°C预变性3min ;94°C模板变性30s，52. 6°C引物退火30s，72°C引物延伸45s，30个循环；72°C延伸IOmin0
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重组质粒YPADC转化上面发酵酵母W303-1A采用醋酸锂转化法。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中的11°P麦汁的制备方法如下大麦芽和小麦芽按重量比3 2混合后，以EBC标准磨进行粉碎，采用浸出糖化法经糖化后，经过滤、煮沸后，制得11° P麦汁。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，上述糖化的具体步骤为投料温度为37°C，保持20min ;升温至45°C保持30min，然后升温至52°C保持40min ;再升温至65°C，保持70min ;最后升温至78°C浸出即可。
全文摘要
本发明公开了一种提高上面发酵小麦啤酒中4-乙烯基愈创木酚含量的方法，将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的PADC基因进行克隆，保留其遗传特性，使其在大肠杆菌中表达，并将该PADC基因转化至上面发酵酵母菌株W303-1A中，以构建一株上面发酵啤酒酵母W303+padc。本方法可显著提高上面发酵小麦啤酒中的4-乙烯基愈创木酚含量，突出小麦啤酒典型的丁香花味。
文档编号C12R1/125GK102899212SQ20121044486
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者崔云前, 周广田 申请人:山东轻工业学院