Alk融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测ALK融合基因的PCR引物、试剂盒和液相芯片。所述液相芯片包括：PCR扩增引物；由tag序列和特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对K15;DEL15A20的SEQ?ID?NO.12、针对K17;A20的SEQ?ID?NO.13、针对K9;A20的SEQ?IDNO.14、针对T6;A20的SEQ?ID?NO.15、和/或针对T3;A20的SEQ?ID?NO.16；微球。本发明所述的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，可一步完成5种融合亚型的扩增，且特异性引物具有非常好的特异性。
【专利说明】ALK融合基因检测的PCR引物、试剂盒和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及ALK融合基因检测的的PCR引物、试剂盒和液相芯片。
技术背景
[0002]ALK基因位于染色体2p23位点，正常情况下人源的alk可转录产生大小6222bp的mRNA,由29个外显子构成，编码1620个氨基酸序列200KDa的I型穿膜蛋白ALK，该蛋白为一种受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase, RTK),是RTK胰岛素超家族的成员。完整的ALK具有典型的RTK三部分结构，即胞外区、亲脂性穿膜区和胞浆内酪氨酸激酶。据文献报道，ALK蛋白除在极少部分弥漫性大B细胞淋巴瘤中表达外，可在60%~85%的原发性系统性ALCL中表达，是原发性系统性ALCL相对特异的免疫表型特征。ALK在某些ALCL中的异常表达来源于不同的染色体易位，每个易位会产生不同的融合蛋白质，由配偶体的5’端和ALK酪氨酸激酶结构域3’端融合得到。在大部分ALK融合基因中，ALK断裂点位于第19内含子内，在mRNA上，断裂点一般位于第20个外显子的第一个核苷酸上。
[0003]目前，与ALK相关的融合基因，除了发现EML4-ALK融合基因之外，又发现了KIF5B-ALK.,KLCl-ALK和TFG-ALK融合基因。在腺癌患者检测中发现了两种KIF5B-ALK基因融合亚型，K15;DEL15A20 和 K17;A20。
[0004]KLCl-ALK融合基因也许并不多见，但是该融合基因在肺腺癌中确实存在。KLCl与ALK基因发生融合，与ALK基因发生t (2; 14) (p23;q32.3)易位产生KLCl-ALK融合基因。这两个基因之间，形成框内基因 融合。完整KLCl-ALK cDNA可能产生的具有984个氨基酸的蛋白质，包含KLCl基因三分之二的氨基末端和ALK基因细胞内区域。研究发现，具有这个融合基因的病人极可能受益于ALK抑制剂治疗。另外，KLCl-ALK融合基因从腺癌(原发生位置细支气管肺泡癌)中被发现。而细支气管肺泡癌很少发现KLCl-ALK融合基因，从病理学角度出发，大规模检测细支气管肺泡癌个体以及对ALK融合基因癌前情况，这是非常有意义的。
[0005]在非小细胞肺癌(NSCLC)中，Rikova等研究发现了 TFG-ALK融合基因，这个融合基因有两种异位的变异型:最近证实为t (2 ；3) (p23;q35)和inv (2) (p23q25)，两种不同的融合蛋白 85kDa (TFG-ALK 短的)和 97kDa (TFG-ALK 长的)是与 t (2 ；3) (p23 ;q25)有关，这种包括TFG (TRF融合基因)，inv (2) (p23q25)包括ATIC基因(以前称为pur_T)，是转录ATIC，其在嘌呤生物合成通路上起着重要作用。
[0006]目前，针对ALK融合基因的研究大部分采用RT-PCR方法以及非放射性同为杂交FISH方法进行检测。RT-PCR方法是针对已知的ALK融合基因的类型以及融合方式来设计引物，将RNA反转录获得cDNA后，通过PCR扩增目的片段的方式来进行检测，则存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。非放射性原位杂交技术FISH法的原理是设计与被检测的ALK融合基因同源互补的核酸探针，二者经过变性一退火一复性，即可形成KALK融合基因的DNA与核酸探针的杂交体。用报告分子(如生物素等)标记核酸探针的某一种核酸，可利用该报告分子与荧光素标记的特异性碱基之间的免疫化学反应，经荧光检测体系的镜下对待测DNA进行定性以及相对定位分析。尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，而且其只能检出融合基因是否存在，不能准确得出具体的融合类型，且灵敏性较低，因而一定程度上限制了该法的应用。鉴于各种融合基因(如ALK融合基因)的表达产物对癌症等疾病的发生发展起着重要作用，因此，本领域迫切需要开发更为实用的融合基因检测方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的之一是提供一种检测ALK融合基因的PCR引物，所述PCR引物可用于单独或并行检测KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因的5种基因融合亚型:KIF5B-ALK 的 K15;DEL15A20、K17;A20 ；KLC1-ALK 的 K9;A20 ；TFG-ALK 的 T6;A20、T3;A20。
[0008]实现上述目的的技术方案如下:
[0009]一种检测ALK融合基因的PCR引物，所述PCR引物为:针对K15; DEL15A20的SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.2、针对 K17;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3、针对 K9;A20 的 SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.4、针对 T6;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.5、和 / 或针对 T3;A20的 SEQID N0.1 和 SEQ ID N0.6。
[0010]本发明的另一目的是提供一种检测ALK融合基因的PCR试剂盒。
[0011]实现该目的的技术方案如下:
[0012]一种检测ALK融合基因的PCR试剂盒，包括有上述的PCR引物。
[0013]在其中一个实施例`中，所述PCR试剂盒还包括有阳性对照品，所述阳性对照品为:针对K15;DEL15A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.2反向互补配对的序列的核酸片段、针对K17;A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.3反向互补配对的序列的核酸片段、针对K9;A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.4反向互补配对的序列的核酸片段、针对T6;A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.5反向互补配对的序列的核酸片段、和/或针对T3;A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.6反向互补配对的序列的核酸片段。更优选地，所述阳性对照品为针对K15;DEL15A20的SEQ ID N0.7、针对K17;A20的SEQ ID N0.8、针对 K9;A20 的 SEQID N0.9、针对 T6;A20 的 SEQ ID N0.10、和 / 或针对 T3;A20 的 SEQ IDN0.11。
[0014]本发明的另一目的是提供一种检测ALK融合基因的液相芯片。
[0015]实现上述目的的技术方案如下:
[0016]—种检测ALK融合基因的液相芯片,包括有:
[0017](A)上述 PCR 引物；
[0018](B).针对ALK融合基因不同融合类型分别设计的ASPE引物:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的融合类型的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对 K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、针对 K17; A20 的 SEQ ID N0.13、针对 K9; A20 的 SEQIDN0.14、针对 T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或针对 T3;A20 的 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.17—SEQ ID N0.26 ；
[0019](C).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.27—SEQ ID N0.36，且所述ant1-tag序列能相应地与(B)中所选的tag序列互补配对。
[0020]在其中一个实施例中，所述ASPE引物为:针对K15;DEL15A20的由SEQ ID N0.17和SEQID N0.12组成的序列、针对K17;A20的由SEQ ID N0.18和SEQ ID N0.13组成的序列、针对K9;A20的由SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.14组成的序列、针对T6; A20的由SEQID N0.20 和 SEQ ID N0.15 组成的序列、和 / 或针对 T3;A20 的由 SEQ ID N0.21 和 SEQ IDN0.16组成的序列。
[0021]本发明的另一目的是提供一种用于检测ALK融合基因的特异性引物。
[0022]具体技术方案如下:
[0023]一种用于检测ALK融合基因的特异性引物，所述特异性引物为:针对K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、针对 K17;A20 的 SEQ ID N0.13、针对 K9;A20 的 SEQ IDN0.14、针对 T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或针对 T3;A20 的 SEQ ID N0.16。
[0024]本发明的主要优点在于:
[0025]1、本发明所提供的ALK融合基因检测液相芯片与测序法的吻合率高达100%。
[0026]2、本发明的检测液相芯片步骤简单，使用逆转录产物作为模板，通过严格筛选的PCR引物，通过一步PCR即可完成含有5种KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因亚型的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的定性分析特征。
[0027]3、本发明的检测试剂盒使用含有目标检测融合亚型序列的质粒载体作为阳性对照品，进一步保证了检测的准确性和可靠性。
[0028]4、本发明所制备的KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，同时，本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的融合基因亚型。
[0029]5、本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用的需要。
[0030]6、本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
[0031]说明书附图
[0032]图1是实施例2中PCR扩增的组I的聚丙烯酰胺凝胶电泳图片。
【具体实施方式】
[0033]本发明实施例中未说明的常规条件和方法，按照本领域技术人员采用的常规方法来进行，如《分子克隆实验指南》第三版，或按照生产厂商所提供的操作方法来实施。
[0034]实施例1 一 种检测ALK融合基因的融合基因检测的PCR引物和阳性对照品
[0035]一、RT-PCR 扩增
[0036]1、逆转录[0037]针对各种目标检测的KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亚型，本发明先使用随机引物对目标检测样本进行逆转录，将样本中mRNA反转录成为cDNA，具体实验步骤参照《分子克隆实验指南》，使用随机引物进行mRNA的反转录为常规操作步骤。
[0038]2、PCR 扩增
[0039]表1中的融合类型为本发明目标检测的5种ALK融合基因亚型，根据该融合基因序列的核酸组成特征，利用Primer5.0设计正向引物和反向引物。使用步骤I所得的cDNA作为模板，对5种目标检测融合基因亚型进行并行扩增。
[0040]所有引物由Invitrogen公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L TrisBuffer配制成300pmol/mL的忙存液。
[0041]其中，K9;A20表示KLCl基因的外显子9和ALK基因的外显子20发生融合。
[0042]表1KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亚型扩增引物
融介祛产物大
融介类鹽il-浪引物 (5.-3,)反N引物(5.- 30
H+ (bp)
K15-DEL1GAATCAGAAATCGGCAA
+233
KIF5B- 5A20CTTTA`G ( SEQID N0.2)
ALKCGTATCTCTCAACATGAA
Κ17;Α20 220
GCCAAA (SEQ ID N0.3 )
[0043]----
KI C' 1-4ATAACCTGGCATCCTGCT TGGTCG AGGTG
K9;A20 198
LKATT (SEQIDN0.4)CGGAGCTT
TCCTCAGCAGCTCACCC (SEQ ID N0.1)
T6;A20172
TFG-ALAC (SEQ 丨D N0.5)
KTTGATAGTTCTGACCTTT
T3;A20153
CCTTTGC ( SEQIDN0.6)
[0044]二、阳性对照品
[0045]本发明根据目标检测ALK融合基因的5种亚型的融合序列特征，设计核酸片段作为检测的阳性对照品，该阳性对照品为含有表1中扩增引物的正向引物和与反向引物反向互补配对的序列的核酸片段，其正向引物和反向引物反向互补配对的序列之间的核酸片段可以是人类基因组序列，也可以是来源于植物、微生物等非人源的核酸序列，且所合成的阳性对照品的片段大小与表1中相应的目标检测融合类型的扩增产物大小一致，从而实现在扩增过程中阳性对照的作用，同时，实现其它的实验目的(例如:当使用来源于植物、微生物等非人源的核酸序列时，可以避免阳性对照品中人类基因组序列对其它检测样本的阳性污染等。)
[0046]本发明检测方法中，针对各种目标检测融合基因亚型，采用插入相应人类基因组序列作为阳性对照品。具体见表2中的SEQ ID N0.7~SEQ ID N0.11，委托金唯智生物科技(北京)有限公司进行目标插入序列的合成，将经过纯化的合成序列插入到PMD18-T载体上，然后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，通过蓝白斑筛选，构建目标检测的5种ALK融合基因亚型重组质粒DNA作为阳性对照品。构建的5种重组质粒经双向DNA测序鉴定正确。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释至5.0X 101°拷贝/毫升于-20° C保存。
[0047]表2KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亚型阳性对照质粒的插入序列
【权利要求】
1.一种检测ALK融合基因的PCR引物，其特征是，所述PCR引物为:针对K15; DEL15A20的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2、针对 K17; A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.3、针对 K9; A20的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.4、针对 T6;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.5、和 / 或针对T3;A20 的 SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.6。
2.一种检测ALK融合基因的PCR试剂盒，其特征是，包括有权利要求1所述的PCR引物。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征是，所述PCR试剂盒还包括有阳性对照品，所述阳性对照品为:针对K15;DEL15A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.2反向互补配对的序列的核酸片段、针对K17;A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.3反向互补配对的序列的核酸片段、针对K9;A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.4反向互补配对的序列的核酸片段、针对T6;A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.5反向互补配对的序列的核酸片段、和/或针对T3;A20的含有SEQ ID N0.1和与SEQ ID N0.6反向互补配对的序列的核酸片段。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征是，所述阳性对照品为针对K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.7、针对K17; A20 的 SEQ ID N0.8、针对K9; A20 的 SEQ ID N0.9,针对 T6;A20 的 SEQ ID N0.10、和 / 或针对 T3; A20 的 SEQ ID N0.11。
5.—种检测ALK融合基因的液相芯片，其特征是，包括有: (A)权利要求1所述的PCR引物； (B).针对ALK融合基因不同融合类型分别设计的ASPE引物:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的融合类型的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对 K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、针对 K17;A20 的 SEQ ID N0.13、针对 K9;A20 的 SEQIDN0.14、针对 T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或针对 T3;A20 的 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.17-SEQ ID N0.26 ； (C).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.27-SEQ ID N0.36，且所述ant1-tag序列能相应地与(B)中所选的tag序列互补配对。
6.根据权要求5所述的液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为:针对K15;DEL15A20的由 SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.12 组成的序列、针对 K17;A20 的由 SEQ ID N0.18 和 SEQIDN0.13组成的序列、针对K9;A20的由SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.14组成的序列、针对T6;A20的由SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.15组成的序列、和/或针对T3;A20的由SEQ IDN0.21和SEQID N0.16组成的序列。
7.根据权利要求5或6所述的液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
8.一种用于检测ALK融合基因的特异性引物，其特征是，所述特异性引物为:针对 K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、针对 K17; A20 的 SEQ ID N0.13、针对 K9;A20 的 SEQIDN0.14、针对 T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或针对 T3;A20 的 SEQ ID N0.16。
【文档编号】C12Q1/68GK103805687SQ201210448636
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】陈昌华, 陈菲, 许昌有 申请人:益善生物技术股份有限公司