专利名称：一种从猕猴桃叶片中提取rna的方法
技术领域：
本发明涉及一种RNA的提取方法，具体指从猕猴桃叶片中提取RNA的新方法。
背景技术：
猕猴桃叶片中总RNA提取质量的好坏是猕猴桃转基因育种反转录合成cDNA成败的关键之一，通过提取猕猴桃叶片中的RNA并结合其它生物技术可获得各种特性的转基因猕猴桃新品种，使得猕猴桃叶片中RNA的提取具有重要应用价值。猕猴桃叶片中可溶性多糖、多酚的含量较高，而多糖、多酚的许多理化性质和RNA相似，易与RNA形成难溶的胶状物共沉淀，造成RNA产量减少，或者多糖、多酚溶解后形成黏稠的溶液污染RNA样品，造成RNA质量降低，从而影响转基因猕猴桃的育种。·现有技术中，Trizol法是大部分植物RNA提取的通用方法，但不适合用于猕猴桃等多糖多酚类植物RNA的提取，用Trizol法提取猕猴桃叶片中RNA时，样品在Trizol缓冲液中很快褐化，在用氯仿抽提时上清液成胶状，多糖多酚的影响非常严重，RNA很难分离，造成RNA纯度低、品质差。因此，开发猕猴桃叶片中RNA的提取新方法，保证猴桃叶片中RNA提取的完整、高纯度和较高的提取率具有重要意义。
发明内容
为解决猕猴桃叶片中RNA提取的技术问题，本发明人通过大量试验，终于发明出一种从猕猴桃叶片中提取RNA的新方法，运用该方法，能保证猴桃叶片中RNA提取的完整、高纯度和较高的提取率。本发明包括以下几个步骤
(I)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后，立即投入质量分数为2% —4%的异硫氰酸胍的50% — 80%的乙醇溶液中，猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为I :50 —I :200 (质量的单位为克，体积的单位为毫升)，常温下浸提I 一 3小时。(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于55 — 75°C水浴锅中温育30 -40分钟，立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为1:10-1 :30，质量的单位为克、体积的单位为毫升，研磨过程中加液氮以防止RNA降解)。把研磨好的，成粘稠状的匀浆液移入离心管中，55 - 75°C温育5 - 15分钟，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(氯仿和异戊醇的体积比为20 : I 一 30:1)，上下剧烈震荡10-90秒，然后于O — 20°C，5000 — 20000 g，离心5 — 60分钟。取上清，重复上述抽提步骤2-4次。取上清，加入上清液1/5 - 1/2体积的5 - 15M LiCl溶液并混匀，_10°C — _50°C条件下放置10-20小时，使RNA沉淀。O — 20°C，5000 — 20000 g，离心5 — 60分钟，弃上清，获粗提的总RNA沉淀。RNA提取缓冲液是一种水溶液，这种溶液中CTAB的质量分数为2%，、PVP40的质量分数为 2%-5%、Tris-Cl 的浓度为 100 mM (pH 8. O)、EDTA 的浓度 25 mM (pH 8. O), NaCl的浓度为2 Μ，β -ME的质量分数为2-5% (用时加入)。(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为5:1-20:1，体积的单位为ml，质量的单位为g)，再加入DEPC处理过的水1/30 - 1/3 体积的 I — 10 M NaAc,1-10 体积的 90 % — 98 % 的乙醇。置于-5°C — -50°C，1-5小时，使RNA沉淀。O — 20°C，5000 — 20000 g,离心5 — 60分钟，弃上清，用50% —
95%乙醇清洗沉淀，空气中干燥后即得RNA。(得到的RNA可加入DEPC处理过的水溶解，保存于_70°C备用或直接用无水乙醇溶解保存)。上述操作过程中，所有的器皿均经过杀灭RNA酶活性处理，使提取的RNA不被破坏；所涉及的酒精浓度，指的是体积比。通过本发明得到的猕猴桃RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，见两条清晰的条带，且两条带亮度比为1.8:1 — 2. 2:1，紫外分光光度计测定A260nm 和A280nm比值，比值在I. 9-2. O之间，是高品质的RNA。本发明的特点是以猕猴桃叶片为材料，用异硫氰酸胍酒精溶液先去除叶片中的多糖、多酚类杂质，避免多糖、多酚类物质对猕猴桃RNA提取的影响，使提取的猕猴桃RNA纯度高、品质好；用异硫氰酸胍酒精溶液去除叶片中多糖、多酚类杂质的同时还保持了 RNA的完整性。
具体实施例方式 以下对猕猴桃叶片中RNA的具体提取方法进行详细说明。实施例I :
(I)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后，立即投入质量分数为2. 2%的异硫氰酸胍的55%的乙醇溶液中，猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为I :60，常温下浸提I. 5小时。(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于65°C水浴锅中温育32分钟，立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为I :15)。把研磨好的，成粘稠状的匀浆液移入离心管中，65°C温育10分钟，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1)，上下剧烈震荡20秒，然后于40C>12000 g，离心10分钟。取上清，重复上述抽提步骤2次。取上清，加入上清液1/4体积的8M LiCl溶液并混匀，-20°C条件下放置12小时，使RNA沉淀。4°C、12000 g，离心10分钟，弃上清，获粗提的总RNA沉淀。(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为10:1)，再加入DEPC处理过的水1/10体积的5 M NaAc，5体积的95%的乙醇。置于_20°C，2小时，使RNA沉淀。4°C、12000 g，离心10分钟，弃上清，用80%乙醇清洗沉淀，空气中干燥后即得RNA。通过上述方法得到的猕猴桃RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，见两条清晰的条带，且两条带亮度比为1.9:1，紫外分光光度计测定么26011111和A280nm比值，比值为1.92。实施例2:
(I)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后，立即投入质量分数为3. 6%的异硫氰酸胍的75%的乙醇溶液中，猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为I :150，常温下浸提2. 5小时。(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于60°C水浴锅中温育37分钟，立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为I :26)。把研磨好的，成粘稠状的匀浆液移入离心管中，60°C温育14分钟，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为29 : 1)，上下剧烈震荡60秒，然后于30CUlOOO g，离心15分钟。取上清，重复上述抽提步骤3次。取上清，加入上清液1/3体积的12M LiCl溶液并混匀，-30°C条件下放置12小时，使RNA沉淀。3°C、11000 g，离心15分钟，弃上清，获粗提的总RNA沉淀。(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为17:1)，再加入DEPC处理过的水1/5体积的6 M NaAc，8体积的91%的乙醇。置于_25°C，I. 8小时，使RNA沉淀。3°C、11000 g，离心15分钟，弃上清，用88%乙醇清洗沉淀，空气中干燥后即得RNA。通过上述方法得到的猕猴桃RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，见两条清晰的条带，且两条带亮度比为2. 1:1，紫外分光光度计测定A260nm和A280nm比值，比值为I. 96。
实施例3
(I)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后，立即投入质量分数为3%的异硫氰酸胍的60%的乙醇溶液中，猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为I :100，常温下浸提2小时。(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于70°C水浴锅中温育35分钟，立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为I :15)。把研磨好的，成粘稠状的匀浆液移入离心管中，70°C温育10分钟，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为21 : 1)，上下剧烈震荡30秒，然后于50C>13000 g，离心10分钟。取上清，重复上述抽提步骤3次。取上清，加入上清液1/4体积的7M LiCl溶液并混匀，-20°C条件下放置12小时，使RNA沉淀。5°C、13000 g，离心10分钟，弃上清，获粗提的总RNA沉淀。(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为10:1)，再加入DEPC处理过的水1/6体积的9 M NaAc，7体积的91%的乙醇。置于_25°C，3. 8小时，使RNA沉淀。5°C、13000 g，离心10分钟，弃上清，用78%乙醇清洗沉淀，空气中干燥后即得RNA。通过上述方法得到的猕猴桃RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，见两条清晰的条带，且两条带亮度比为2:1，紫外分光光度计测定A260nm和A280nm比值，比值为I. 93。
权利要求
1.一种猕猴桃叶片中RNA的提取方法，其特征在于包含以下几个步骤 (1)猕猴桃叶片的前处理。将刚摘取的猕猴桃叶片剪碎后，立即投入质量分数为2%—4%的异硫氰酸胍的50% — 80%的乙醇溶液中，猕猴桃叶片与溶液的质量体积比为I :50 —·I :200，常温下浸提I — 3小时。
(2)猕猴桃总RNA的提取。将RNA提取缓冲液于55— 75°C水浴锅中温育30 -40分钟，立即取上述处理的叶片加缓冲液于研钵中快速研磨(叶片与缓冲液的质量体积比为I :·10 - I :30)。把研磨好的，成粘稠状的匀浆液移入离心管中，55 - 75°C温育5 — 15分钟，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液(混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为20 : I -·30 :1)，上下剧烈震荡10-90秒，然后于O — 20°C、5000 — 20000 g，离心5 — 60分钟。取上清，重复上述抽提步骤2 — 4次。取上清，加入上清液1/5 - 1/2体积的5 - 15M LiCl溶液并混匀，_10°C— -50°C条件下放置10-20小时，使RNA沉淀。O — 20°C、5000 — 20000g，离心5 - 60分钟，弃上清，获粗提的总RNA沉淀。
(3)猕猴桃RNA的纯化。加入DEPC处理过的水溶解上述得到的总RNA(水与总RNA的体积质量比为5:1-20:1 )，再加入DEPC处理过的水1/30 — 1/3体积的I — 10 M NaAc, I — 10体积的90 % — 98 %的乙醇。置于-5 V - -50 °C, 1-5小时，使RNA沉淀。O — 20°C，5000 —·20000 g，离心5 - 60分钟，弃上清，用50% — 95%乙醇清洗沉淀，空气中干燥后即得RNA。
全文摘要
本发明公开了一种从猕猴桃叶片中提取RNA的方法，该方法包括(1)猕猴桃叶片的前处理，用异硫氰酸胍的酒精溶液去除猕猴桃叶片中的多糖、多酚类杂质，避免多糖、多酚类物质对猕猴桃RNA提取的影响，(2)猕猴桃叶片中总RNA的提取，(3)猕猴桃RNA的纯化。利用本发明方法提取猕猴桃叶片中的RNA，可有效去除叶片中多糖、多酚类物质对猕猴桃RNA提取的影响，使提取的猕猴桃RNA纯度高、品质好并保持较好的完整性。
文档编号C12N15/10GK102899319SQ201210449428
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者田宏现, 彭司英 申请人:吉首大学