专利名称：柑橘碎叶病毒的rt-lamp检测方法
技术领域：
本发明属于一种环介导等温扩增(ReverseTranscriptionLoop-MediatedIsothermal Amplification, RT-LAMP)分子检测方法，特别涉及ー种柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法。
背景技术：
柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)是威 胁柑桔生产的重要病原之一。CTLV在我国浙江、湖南、福建和广西等地的局部地区曾造成比较严重的危害。应用和推广无病毒柑桔苗木是CTLV防治的有效措施。目前,柑桔无病毒苗木三级繁育体系已在我国多个柑桔产区建立，无病毒苗木得到了大面积的推广。为保证种苗安全，必须对采穗母本树进行定期鉴定，并对感染病毒的良种进行脱毒处理。这必然要求快速、灵敏的病毒检测技术。CTLV是发状病毒属(Capillovirus)正义单链RNA病毒，病毒粒子呈弯曲线状，大小约为600 700nmX 15nm,基因组全长约6496nt, 5’端具帽子结构，3’端具Poly(A)尾巴。目前应用腊斯克枳橙等指示植物鉴定是CTLV检测的常规手段之一，但其检测周期较长(1-2年)并易受环境条件影响。血清学检测技术大大提高了 CTLV的检测速度，在美国、日本等国得到广泛应用。Kawai等还制备了 CTLV单克隆抗体用于酶联免疫法检测。但抗体制备不易，检测灵敏度有待提高。而RT-PCR检测方法以其速度快、灵敏度高、特异性好等特点受到青睐。但是，它需电泳及特殊仪器，不便于在田间大规模应用。LAMP是由Notomi于2000年开发的ー种新型的核酸扩增技术，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行靶序列高效扩増。它避免了常规PCR温度循环的特殊要求，并且因其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点，又在另ー层面上提高了它的应用价值。目前还没有研究建立特异、灵敏以及操作简单的柑橘碎叶病毒RT-LAMP检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，提供一种灵敏度高、特异性强、不需要电泳及特殊仪器的柑橘碎叶病毒RT-LAMP检测方法，用于柑橘碎叶病毒的田间早期诊断。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为ー种柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法，包括反应体系，所述反应体系中含有特异性引物组，其特征在于所述特异性引物组为以下四组中的任意ー组第一组omp-FIP5! -AGCTTTCGGAACGTACATTCGTAATGTTGTCCCTGAGTTGAA-3!omp-BIP
5' -CCTTTTGCTGATTTGGCTCGTGGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F3 5' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B3 5' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'；第二组omp-FIP
5' -AAGGCTCACAAAGCTTTCGGAAAACCTTTGCTGCTACTTCT-3'omp-BIP5' -TTGCTGATTTGGCTCGTGAATTGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F3 5' -AGAAAGCCAGAGAAGGGT-3'omp-B3 5' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'；第三组omp-FIP5' -GCTGAGAAGTAGCAGCAAAGGTAACTAAGATTTGGAGGATCGAC-3'omp-BIP5' -TTCCGAAAGCTTTGTGAGCCTTTTGGACCACCGTTCATG-3'omp-F3 5' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B3 5' -GTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'；第四组omp-FIP5' -ACGAAAAAGCCTCTTGGTCATTCT-AAAATGAATCGTCTAACACCTGA-3'omp-BIP5' -AAGGACAGAAAGGGGTTTTCG-TTGCGGAATTTTAAACGACTC-3'omp-F3 5' -ATTTGATTTTGCTACTGGTCT-3'omp-B3 5' -ATGTCAACCTGCAAGACC-3'。本发明利用每组特异性引物中的4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，进行靶序列高效扩增，建立了简便、快速、成本低、灵敏度高和特异性强的CTLV环介导等温扩增(LAMP)检测方法，便于在田间大規模快速应用。本发明的柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法具体按照如下步骤完成(I)柑橘碎叶病病叶总RNA提取，采用Trizol法、微量抽提；(2)柑橘碎叶病的RT-LAMP扩增，配置反应体系为25 U L,所述反应体系中各组分的含量为 5 X Reaction Buffer [IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5%Tween 20]、6mM MgSO4U. 2mM dNTPs、0. 6M Betaine、Bst RNA 聚合酶 8U、AMV-RNA 反转录酶2U, IuM omp-FIP、I u M omp_BIP、0. 5 u M omp_F3、0. 5 u Momp_B3、模板 RNA I. 0 u L,加 ddH20补足，混匀，于63°C水浴锅中反应60-80min，之后80°C下灭活IOmin结束反应；(3)反应结束后，观察浊度，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；或在反应液中加入显色液，出现绿色表明为阳性，橙色则表明为阴性；0. 5 L反应液进行琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱，图谱中出现特征性梯状条带为阳性，未出现特征性梯状条带为阴性。在上述技术方案中，所述步骤(I)的具体操作为A、取0. Ig柑橘叶片,液氮充分研磨后加入预先放置有ImlTranzol up溶液的微型离心管中，涡旋混匀lmin，然后室温放置5-lOmin将上述微型离心管在WOOOrpm，4°C下离心 15min ；B、取上清液Iml置于第二只微型离心管中，并在其中加入氯仿200iiL或I-溴-3-氯丙烷100 u L，用手摇15s，然后在室温或4°C放置IOmin ；C、将第二只微型离心管在12000rpm，4°C下离心IOmin后，再取上清液650 u L加入第三只微型离心管中，加入585-650 u L的异丙醇,颠倒混勻，-20°C放置30min_lh,然后在12000rpm,4°C下离心IOmin,弃上清液,再离心15s用枪头吸弃上清液；D、在第三只微型离心管中加入用DEPC水配制的75%的こ醇溶液1ml，该こ醇溶液的温度为-20°C,颠倒、润旋至混勻，然后在8000rpm,4°C下离心3min,弃上清液,再离心15s，用枪头吸弃上清液；
E、按照步骤D的方法再洗涤一次沉淀，然后将RNA沉淀置于通风橱中室温干燥 2-3min，然后加入 50 y L-100 u L DEPC 水或 DEPC 水配 I XTE 溶解 RNA，55-60 °C 孵育3-5min)，轻轻涡旋混匀，得到模板RNA溶液。有益效果本发明的RT-LAMP检测方法具特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点，无需电泳及特殊仪器，便于在田间大规模应用，该方法为CTLV病害监测构建了一个快速检测的技术平台。说明书附I为本发明特异性的琼脂糖凝胶电泳图，其中I为第一组引物跑出来的模板RNA的特征性梯状条帯，2为第二组引物跑出来的模板RNA的特征性梯状条帯，3为第三组引物跑出来的模板RNA的特征性梯状条帯，4为第四组引物跑出来的模板RNA的特征性梯状条带，5 为衰退病毒、类病毒(包括 CEV(裂皮病)，CBLVcU HSVcU CVd-II I、CVd-IV、CVd-OS,CVd-V、Vd-I-LSS八种病毒)、温州蜜柑矮缩病毒以及啤酒花矮化病毒的混合样，6为阴性对照、7 为 marker。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进ー步的说明实施例I :(I)柑橘碎叶病病叶总RNA提取，采用Trizol法、微量抽提；利用Trizol法提取柑橘基因组RNA，具体操作如下A、取0. Ig柑橘叶片，液氮充分研磨后加入预先放置有ImlTranzol up溶液的微型离心管中，涡旋混匀lmin，然后室温放置5-10min，将上述微型离心管在12000rpm，4°C下离心 15min ；B、取上清液Iml置于第二只微型离心管中，并在其中加入氯仿200iiL或
I-溴-3-氯丙烷IOOii L，用手剧烈摇晃15s，然后在室温或4°C放置IOmin ；C、将第二只微型离心管在12000rpm，4°C下离心IOmin后，再取上清液650 u L加入第三只微型离心管中，加入585-650 u L的异丙醇,颠倒混勻，-20°C放置30min_lh,然后在12000rpm,4°C下离心IOmin,弃上清液,再离心15s用枪头吸弃上清液；D、在第三只微型离心管中加入用DEPC水配制的75%的こ醇溶液1ml，该こ醇溶液的温度为-20°C,颠倒、润旋至混勻，然后在8000rpm,4°C下离心3min,弃上清液,再离心15s，用枪头吸弃上清液；E、按照步骤D的方法再洗涤一次沉淀，然后将RNA沉淀置于通风橱中室温干燥
2-3min,然后加入 50 u L-100 u L DEPC 水或 DEPC 水配 I X TE 溶解 RNA，55-60°C孵育 3_5min，轻轻涡旋混匀，短暂离心后分装小份，得到模板RNA溶液。该RNA溶液可在-20°C保存或-80°C长久保存。(2)柑橘碎叶病的RT-LAMP扩增,配置反应体系为25 ii L,所述反应体系中各组分的含量为 5 X Reaction Buffer [IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5%Tween 20]、6mM MgSO4U. 2mM dNTPs、0. 6M Betaine、Bst RNA 聚合酶 8U、AMV-RNA 反转录酶2U，第一组特异性引物中的 omp-FIP IuM,omp-BIP liiM 、omp_F3 0. 5 y M、omp_B3 0. 5 u M,模板RNA l.OuL,加ddH20补足，混匀。均于63°C水浴锅中反应60_80min，之后80°C下灭活IOmin结束反应,其中第一组引物中的omp-FIP、omp-BIP、omp-F3、omp-B3的碱基序列为omp-FIP5' -AGCTTTCGGAACGTACATTCGTAATGTTGTCCCTGAGTTGAA-3'omp-BIP5' -CCTTTTGCTGATTTGGCTCGTGGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F35' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B35' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'。此次实验用样品 I 来表示。(3)将步骤(2)反应体系不变，只是将其中的特异性引物组换为第二组特异性引物组，它们的碱基序列为omp-FIP5' -AAGGCTCACAAAGCTTTCGGAAAACCTTTGCTGCTACTTCT-3'omp-BIP5' -TTGCTGATTTGGCTCGTGAATTGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F3 5' -AGAAAGCCAGAGAAGGGT-3'omp-B3 5' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3';重复步骤(2)的实验。将此次实验结果作为样品2。(4)仍然是将步骤(2)反应体系不变，只是将其中的第一组特异性引物组换为第三组特异性引物组，它们的碱基序列为omp-FIP5' -GCTGAGAAGTAGCAGCAAAGGTAACTAAGATTTGGAGGATCGAC-3'omp-BIP5' -TTCCGAAAGCTTTGTGAGCCTTTTGGACCACCGTTCATG-3'omp-F3 5' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B3 5' -GTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'。重复步骤(2)的实验。将此次实验结果作为样品3。(5)仍然是将步骤(2)反应体系不变，只是将其中的第一组特异性引物组换为第四组特异性引物组，它们的碱基序列为omp-FIP5' -ACGAAAAAGCCTCTTGGTCATTCT-AAAATGAATCGTCTAA CACCTGA-3'omp-BIP5' -AAGGACAGAAAGGGGTTTTCG-TTGCGGAATTTTAAACGACTC-3'omp-F3 5' -ATTTGATTTTGCTACTGGTCT-3'
omp-B3 5' -ATGTCAACCTGCAAGACC-3'。重复步骤(2)的实验。将此次实验结果作为样品4。(6)同时以阴性样品(样品6)和marker (样品7)作为对照，重复步骤⑵的实验。(7)反应结束后，观察浊度，样品1-4出现白色浑浊即为阳性；样品6和7没有出现白色浑浊为阴性。或在各反应液中加入显色液SYBR GREEN I (1000*)，样品1_4出现绿色表明为阳性，样品6-7橙色则表明为阴性；或取0. 5 2微升各个反应液进琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱如图I所示，图谱中样品1-4出现特征性梯状条带为阳性，样品6 -7未出现特征性梯状条带为阴性。同样，我们将阴性样品和marker作为对照重复步骤3-5的实验，均未出现白色浑浊，用显色液显色也均为橙色，用琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱也未出现特征性梯状条带。通过NCBI进行对比，反应区域特异，仅有苹果茎沟病与柑橘碎叶病同源性较高。且用该RT-LAMP方法分别以柑橘衰退病、类病毒(包括CEV (裂皮病)，CBLVd, HSVd,CVd-III, CVd-IV、CVd-OS, CVd-V, Vd-I-LSS八种病毒)、温州蜜柑矮缩病、啤酒花矮化病毒等柑橘病害的RNA为模板，或者将它们的RNA混合作为模板，同样以阴性样品和水做负对照及空白对照，用以上四组特异性引物分别进行RT-LAMP特异性检测，结果表明，只有CTLV样品为阳性，对照组均为阴性，说明该方法特异性強；另外，通过采用碎叶病外壳蛋白菌液进行稀释比对，进行了 RT-LAMP和普通PCR的灵敏度检测，结果发现RT-LAMP的灵敏度明显强于 RT-PCR。
权利要求
1.一种柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法，包括反应体系，所述反应体系中含有特异性引物组，其特征在于所述特异性引物组为以下四组中的任意一组 第一组omp-FIP5' -AGCTTTCGGAACGTACATTCGTAATGTTGTCCCTGAGTTGkk-3'omp-BIP 5' -CCTTTTGCTGATTTGGCTCGTGGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F35' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B35' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'； 第二组omp-FIP5' -AAGGCTCACAAAGCTTTCGGAAAACCTTTGCTGCTACTTCT-3/omp-BIP5' -TTGCTGATTTGGCTCGTGAATTGTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'omp-F35' -AGAAAGCCAGAGAAGGGT-3'omp-B35' -CATCAGGTGTTAGACGATTCA-3'； 第三组omp-FIP5' -GCTGAGAAGTAGCAGCAAAGGTAACTAAGATTTGGAGGATCGAC-3'omp-BIP5' -TTCCGAAAGCTTTGTGAGCCTTTTGGACCACCGTTCATG-3'omp-F35' -GGGAAACTGAAGAAGAGAAGAA-3'omp-B 35' -GTTTCTTGTATATGTTGGTGGC-3'； 第四组omp-FIP5' -ACGAAAAAGCCTCTTGGTCATTCT-AAAATGAATCGTCTAACACCTGA-3'omp-BIP5' -AAGGACAGAAAGGGGTTTTCG-TTGCGGAATTTTAAACGACTC-3'omp-F35' -ATTTGATTTTGCTACTGGTCT-3'omp-B35' -ATGTCAACCTGCAAGACC-3'。
2.根据权利要求I所述柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于按照如下步骤完成 (1)柑橘碎叶病病叶总RNA提取，采用Trizol法、微量抽提； (2)柑橘碎叶病的RT-LAMP扩增，配置反应体系为25μ L，所述反应体系中各组分的含量为 5XReaction Buffer[IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5 %Tween 20]、6mM MgSO4U. 2mM dNTPs、0. 6M Betaine、Bst RNA 聚合酶 8U、AMV-RNA 反转录酶2U，权利要求I中的任意一组特异性引物组，引物组中的omp-FIP I μ M、omp-BIP I μ Μ、omp-F30. 5 μ M、omp-B30. 5 μ Μ、模板 RNA I. O μ L，加 ddH20 补足，混匀，于 63°C水浴锅中反应60-80min,之后80°C下灭活IOmin结束反应； (3)反应结束后，观察浊度，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；或在反应液中加入显色液，出现绿色表明为阳性，橙色则表明为阴性；或用O. 5 2μ L反应液进行琼脂糖凝胶电泳，获取电泳图谱，图谱中出现特征性梯状条带为阳性，未出现特征性梯状条带为阴性。
3.根据权利要求2所述柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于所述步骤(I)的具体操作为 Α、取O. Ig柑橘叶片，液氮充分研磨后加入预先放置有ImlTranzol up溶液的微型离心管中，涡旋混匀lmin，然后室温放置5-10min将上述微型离心管在12000rpm，4°C下离心15min ； B、取上清液Iml置于第二只微型离心管中，并在其中加入氯仿200μ L或I-溴-3-氯丙烷100 μ L，用手摇15s，然后在室温或4°C放置IOmin ； C、将第二只微型离心管在12000rpm，4°C下离心IOmin后，再取上清液650μ L加入第三只微型离心管中，加入585-650 μ L的异丙醇，颠倒混勻，_20°C放置30min_lh,然后在12000rpm,4°C下离心IOmin,弃上清液,再离心15s用枪头吸弃上清液； D、在第三只微型离心管中加入用DEPC水配制的75%的乙醇溶液1ml，该乙醇溶液的温度为-20°C,颠倒、润旋至混勻,然后在8000rpm,4°C下离心3min,弃上清液,再离心15s,用枪头吸弃上清液；E、按照步骤D的方法再洗涤一次沉淀，然后将RNA沉淀置于通风橱中室温干燥2-3min，然后加入50 μ L-100 μ L DEPC水或DEPC水配I X TE溶解RNA，55-60°C孵育·3-5min)，轻轻涡旋混匀，得到模板RNA溶液。
全文摘要
本发明公开了一种柑橘碎叶病毒的RT-LAMP检测方法，包括反应体系，所述反应体系中含有特异性引物组，并给出了四组不同的特异性引物组，该方法具特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点，无需电泳及特殊仪器，便于在实验室和田间快速检测，该方法为柑橘碎叶病监测构建一个快速检测的技术平台。
文档编号C12Q1/68GK102952899SQ20121045079
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者段硕, 周常勇, 李敏, 宋震, 李中安 申请人:中国农业科学院柑桔研究所