专利名称：一种大白菜eIF(iso)4E.c位点碱基缺失突变的特异性分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因的突变体及其相关位点特异性分子标记的开发，尤其涉及一种大白菜真核生物翻译起始因子eIF(iS0)4E. c的碱基缺失突变及其位点特异性分子标记开发和应用。突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒大白菜种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的大白菜材料，提高 eIF4E突变体的选择效率，属于生物技术领域。
背景技术：
大白菜(Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原产于中国，目前在世界各地均有种植。尤其在我国蔬菜的常年供应和淡季蔬菜调剂中已经成为蔬菜产品供给的重要组成部分，因而对人们生活具有重要影响。在大白菜生产过程中，常遭病毒病、霜霉病和软腐病等病害的威胁。就整体而言病毒病的危害最为严重，且没有普遍适用的抗病毒病药剂或其它行之有效的控制技术。培育抗病毒大白菜新品种是应对病毒病危害的首选途径[王雪，刘玉梅，李汉霞，张扬勇，方智远.芸薹属作物抗芜菁花叶病毒育种研究进展.园艺学报.2005，32 (5): 939-946]。苗立强等[苗立强，张耀伟，崔崇士 .我国白菜抗病育种研究进展.东北农业大学学报.2008, 37 (4) : 529-533]研究发现，我国大白菜病毒病的病原分离物中70%是芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)、还有少量黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)和其它病毒。因此我国大白菜抗病毒病育种的主攻目标是抗TuMV。
培育抗TuMV大白菜新品种的两个关键要素是拥有丰富的抗TuMV种质资源和高效的育种效率。我国是大白菜原产地，种质资源非常丰富，其中不乏抗TuMV的优良资源，同时也有更多品质优良但不抗病毒的资源。在常规育种实践中，常通过回交转育的手段获得更多遗传背景丰富的抗性材料。随着分子标记技术的兴起及研究的深入，标记辅助选择在常规育种操作中已经成为提高选择效率、缩短育种年限的主要手段。一些跨国的育种集团更是不惜重金把创新资源和开发与重要农艺性状紧密连锁的分子标记作为育种攻关的主要内容。
一般而言，要寻找与某农艺性状紧密连锁的分子标记，往往需要先选择在目标性状方面存在显著差异的亲本，并构建分离群体$2，1 1，8(1，0!1等)，采用混合分群(BSA) 和传统的分子标记(如RAPD，SRAP, AFLP, SSR等)技术进行分析，用相应的软件分析所得标记与性状的连锁距离，最终得到与目标性状连锁的分子标记。目前报道的与大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)位点连锁的分子标记正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所选择的标记类型不同，所得到的与抗病毒特性连锁的标记距离亦不同，介于 3. 8-15. 36cM。由于这些标记与性状的连锁程度不够紧密，因而其用于大白菜抗TuMV辅助育种尚有一定的距离。
另一方面，由于拟南芥与大白菜同属十字花科，其抗病毒相关功能基因已有较深入的研究；同时大白菜的全基因组序列已经公布[Wang et al.，2011，the genome of the mesopoIyploidcrop species Brassica rapa. Nature Genetics. 43(10):1035-1039]。所以可以将拟南芥功能基因研究的结果和大白菜基因组序列信息结合，直接从抗病毒相关功能基因的角度入手，通过对大白菜自然群体在某一个重要功能基因位点的自然变异入手，寻找抗病毒相关功能基因的突变体；针对突变位点开发位点特异性分子标记(Allele specific marker, ASM)，则这种标记本身与性状直接相关，这无疑会使标记辅助选择更加精准。
在抗病毒功能基因研究方面近年来发现，由隐性单基因控制的抗病毒性状多与真核生物翻译起始因子4E及其异构体的突变有关。Wittmann等[Wittmann S，Chatel H，Fortin MG，Laliberte JF. Interaction of the viral protein genome linked of Turnip mosaic virus with thetranslational eukaryotic initiation factor(iso)4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two-hybridsystem. Virology. 1997,234:84-92]和 L6onard 等[L6onard S，Plante Dj Wittmann Sj DaigneaultNj Fortin MG，LaliberteJF. Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryoticinitiation factor 4E correlates with virus infectivity. J. Virol. 2000，74:7730-7737]分别证明拟南芥 eIF4E 和 eIF (iso) 4E 可以同TuMV的病毒基因组结合蛋白(VPg)相互作用。这种相互作用的关键氨基酸与真核生物自身mRNA翻译所需的关键氨基酸位点不同，所以eIF4E及eIF(is0)4E的一些氨基酸突变不影响植物自身的生长发育、却导致病毒与寄主不能发生互作，从而使寄主表现出抵抗病毒侵染的特性。Ryder 在生菜[Ryder EJ. 1970. Inheritance of resistance tocommon lettuce mosaic. Am Soc Horticult Sci. 95:378 - 379]、Ruffel 在辣椒[Ruffel Sj DussaultMHj Palloix A,Moury B，Bendahmane A, Robaglia Cj Caranta C.2002.A natural recessiveresistance gene against potato virus Y in peper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) · Plant J. 2002 Dec;32 (6):1067-75]、 Nieto 在舌甘瓜[Nieto C，Piron F，Dalmais M，Marco CF，Moriones Ej Gomez-Guillamon ML，Truniger V, Gomez P, Garcia-Mas J，Aranda MAj Bendahmane A. 2007. EcoTILLING for the identification of allelic variants of melon eIF4E，afactor that controls virus susceptibility. BMC Plant Biology. 7，34-42]等重要蔬菜作用中已经发现了不少这样的突变体资源，Yeam 等[Yeam I，Kang BCj Lindeman W，Frantz JDj Faber N，andjahn MM. 2005. Allele-specific CAPS markers based on point mutations in resistance alleles at thepvrI locus encoding eIF4E in Capsicum.Theor.Appl.Genet. NN0, 178-186]在辣椒中针对突变位点开发了相应的位点特异性CAPs标记并用于抗病毒材料转育时的辅助选择。
从其他作物的eIF4E和eIF (iso) 4E突变及其在抗病毒中的作用推测，大白菜自然群体中也可能存在eIF4E和eIF(is0)4E的突变体，且这种突变可能与大白菜的抗病毒特性有关。我国大白菜种质资源十分丰富，但目前，国内外有关大白菜抗病毒特性与 eIF4E和eIF(iso)4E关系的研究很少，涉及的材料极为有限。Rusholme等[Rusholme RL, Higgins EE, Walsh JA, Lydiate DJ. Genetic control of broad-spectrum resistance to turnip mosaic virus in Brassica rapa (Chinese cabbage). Journal of GeneralVirology. 2007, 88:3177 - 3186]以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料 R-0-18为亲本，构建BClFl群体，进行抗TuMV(⑶NI和CZEl株系)遗传研究。结果发现了一个大白菜抗病毒隐性遗传位点retrOl和一个显性位点ConTROl, RFLP标记关联分析分别发现了与retrOl连锁的标记pN202el和与ConTROl连锁的标记p085el。进一步采用southern 杂交的手段发现，在A基因组中分别有3个拷贝的eIF4E (分别位于染色体NI、N3和NS)和 3个拷贝的eIF(is0)4E (分别位于染色体N4、N5和NS)。作者根据杂交结果，推测位于第8 染色体上的eIF4E和eIF (iso) 4E可能与ConTROI有关，而位于第4染色体上的eIF (iso) 4E 可能与retrOl有关。文中没有关于两个基因的序列信息报道。Jenner等[Jenner CE, Nellist CF, Barker GC, Walsh JA. Turnip mosaic virus (TuMV) is able touse alleles of both eIF4E and eIF (iso)4E from multiple loci of the diploid Brassica rapa. Mol PlantMicrobe Interact. 2010, 3(11): 1498-1505]从病毒敏感材料 R-0-18 中克隆得到了 eIF4E 和 eIF(iso)4E 各三个拷贝，分别命名为 BraA. eIF(iso)4E. C、BraA. eIF4E. b、 BraA. eIF4E. c 和 BraA. eIF(iso)4Ε· a>BraA. eIF(iso)4E. b、BraA. eIF(iso)4E. c。除 BraA. eIF4E. b和BraA. eIF(iso)4E. b以外，其余4个基因分别转化拟南芥At. eIF(iso)4E功能缺失突变体[DupratA, Caranta C，ReversF, Menand B, Browning KS, Robaglia C. 2002. The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses. The PlantJournal, 32:927 - 934], 然后对所有转基因株系接种TuMV加拿大株系CDNl，进行病毒敏感性互补实验。根据病情指数及ELISA结果，发现所转的四个基因均能使突变体完全或部分恢复对TuMV侵染的敏感性。这表明，在TuMV侵染白菜类蔬菜作物时，eIF4E和eIF (iso) 4E都可能参与病毒与寄主的相互作用。同时作者指出，要想在大白菜中获得与eIF4E和eIF(iso)4E有关的抗病毒材料，则这几个基因需同时丧失功能。截止目前，大白菜在上述两个基因位点的突变及相关突变体检测的标记开发国内外未见报道。
鉴于此，有必要对我国丰富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF (iso) 4E各个位点的多态性进行广泛筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。有以下几个方面的潜在益处①可以将该标记用于筛查大白菜种群，提供高效的大白菜突变体检测手段；②当其他位点发现突变类型时，可以采用同样的方法开发标记；③当多个位点的突变位于不同的材料中时，可以通过标记辅助选择手段将多位点的突变聚合在一起，创造广谱抗TuMV大白菜新种质；④在培育广谱抗TuMV大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。 由于这种标记直接位于功能基因内部，因此选择的准确率达100%。发明内容
针对上述现有技术，针对目前大白菜在eIF4E和eIF (iso) 4E基因位点突变体鉴定方面的空白，本发明首先获一个eIF(is0)4E. c位点的碱基缺失突变体，其次根据突变位点的序列特点，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的ASM共显性标记并用于标记辅助选择。
本发明是通过以下技术方案实现的
一种与大白菜eIF(is0)4E. c野生型和碱基缺失突变体鉴定直接相关的位点特异5性共显性ASM标记与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小128bp，如SEQ ID No. I所示；对应的碱基缺失突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小124bp，SEQ ID No. 2 所示。
用于鉴别上述特异性共显性分子标记的引物是
正向引物PFl :5’ -CGAAGAAGAATATGGCGACAGA-3’ ；
PF2 :5’-ACATTCACATGTTCAAAGCTGGTGTT-3’ ；
反向引物PRl : 5’ -CTATTCTCTTGCATTGTTTGAGCG-3’ ；
PR2 :5’ -AGTTTCAAGCCAAGCCTTGTCTAAAG-3’ ；如 SEQ ID NO. 3、4、5、6 所示。
本发明采用同源克隆技术从一份大白菜抗TuMV和一份大白菜感TuMV自交系材料中分别克隆到了 eIF (i so) 4E. c基因全序列，将2个序列与GenBank中已经报道的 B. rapa自交系R-0-18的eIF (iso) 4E. c比较后，发现来自敏感材料的eIF (iso) 4E. c与已经报道的完全一致，而来自病毒抗性材料的eIF(is0)4E. c则缺失了四个碱基，且该缺失位点位于外显子区域。这表明来自抗性材料的eIF(iS0)4E.C是个突变体，用小写字母表示即eIF(iS0)4e. Cl,以区别与本课题组鉴定的另一个在该位点的转座子插入突变体 eIF(iso)4e.c2。
由于大白菜有三个eIF(is0)4E基因，且三者之间同源性较高，我们采用了巢式 PCR技术来扩增这一突变位点。我们首先分析了大白菜三个eIF(iso)4E的基因组序列，确定了扩增eIF(is0)4E. c的特异引物，进行第一轮PCR扩增，然后针对突变位点两侧的保守序列，设计嵌套引物，进行第二轮PCR。扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺(8%)凝胶电泳，即可将野生型和突变体进行有效分离。经过对抗/感材料的F2代群体分析表明，该方法对野生型、突变体以及杂合型的鉴别效率达100%。
所述ASM标记的筛选过程如下
(I)以大白菜抗TuMV自交系Hel02和TuMV敏感自交系06-247为材料，采用CTAB 法，提取两者的基因组DNA。
(2)依据GenBank中已经报道的B. rapa自交系R-O-18的eIF (iso) 4E. c序列，在编码区上下游设计引物。采用同源克隆技术，从两份材料中分别克隆得到了其eIF(is0)4E. c并进行测序。
(3)将所得eIF(iso)4E. c与R-O-18的eIF(iso)4E. c序列分别进行比较，发现了一处4碱基缺失突变；同时对编码区序列进行推导和翻译产物的预测，发现来自病毒敏感材料06-247的eIF(iso)4E. c其基因组序列以及推导的编码区序列与R-0-18完全一致。而来自抗性材料Hel02的eIF (iso) 4E. c缺失了四个碱基，经过编码区推导，发现这四个碱基恰好位于编码区第411bp-414bp处，该缺失导致移码突变和翻译产物提前终止。据此，根据 eIF(iso)4E. c基因的保守性，在碱基缺失位点两侧分别设计两套引物，进行巢式PCR扩增， 第一套引物能够特异性地将eIF(is0)4E. c的基因组序列扩增出来，再以此为模板，加入内侧嵌套引物，进行第二轮PCR扩增，结果同时将野生型位点和突变位点扩增了出来，此即为共显性位点特异性标记(ASM)。
所述标记可以作为分子标记应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育，选择含有Hel02中eIF (iso) 4E. c碱基缺失突变类型的种质材料或转育后代。具体应用方式为利用ASM标记的两套引物组合对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段大小，如果扩增出128bp的条带，则为野生型；扩出124bp的条带则为突变型；如果同时扩出两条带，则为杂合型。
本发明的有益效果是由于大白菜eIF4E位点上受多个基因的控制，在同一份材料中多基因同时突变的频率较低。如果能够分别在各个位点鉴定出各自的突变体，开发针对各个突变体检测的位点特异性分子标记，则可以通过聚合杂交并结合分子标记辅助选择，将多个突变位点聚合在同一份材料中。本发明利用同源克隆技术发现了 eIF(iS0)4E.C 位点的一个碱基缺失突变体并开发了鉴定该位点的分子标记。利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择。同时该标记还可用于对大白菜种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料。其优点具体如下
I.本发明获得的与eIF(is0)4E. c位点碱基缺失突变直接相关的标记，结果稳定、 准确、操作简便。适用于不同遗传背景大白菜材料的筛选，是一个普遍性标记。它能够准确鉴定大白菜种质资源在该位点的基因型，极大地提高了对大白菜种质资源在eIF(iso)4E. c 位点突变体的筛选效率。
2.在大白菜eIF4E基因序列及突变型研究方面，仅Jenner等(2010)报道了 B. rapa的一个自交系R_0_18的序列，其它突变体未见报道。针对该突变位点的特异标记， 可以为种质资源鉴定、通过回交转育等手段筛选和培育不同遗传背景的突变体材料提供辅助选择工具。本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。
图I :两份大白菜材料eIF(iso)4E. c基因的扩增(琼脂糖凝胶电泳)，M为DNA分子量标准DL5000。
图2 Hel02与06-247的eIF (iso) 4E. c基因组序列比对(图中示有差异的部分)。
图3:来自 06_247 (野生型&'aelFQsoME· c)与 Hel02 (突变体&'aeIF(iso)4e. c)的氨基酸顺序比较(图中示有差异部分)。
图4 :巢式引物在亲本中的扩增(即ASM标记开发)结果。
图5 :巢式引物在亲本及F2群体中部分单株的扩增情况(Pl :亲本I即06-247 ； P2 :亲本2即Hel02 ;1_21是F2代21个单株，其中6、11、12、15、17和20同亲本1，10、16同亲本2，其余单株为杂合型)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明， 均为常规方法。
实施例I、不同大白菜自交系材料中eIF(is0)4E. c的克隆
I. I大白菜基因组DNA提取
(I)将大白菜幼苗叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每IOOmg材料约加入O. 6ml预热至65°C的CTAB提取液，融化后，剧烈振荡混匀样品，65°C水浴放置40-60分钟使细胞裂解；
(3)裂解结束后，取出样品使其完全冷却至室温。加入等体积的氯仿(chloroform),轻轻颠倒使混勻，室温放置10分钟；
(4)室温，12000rpm 离心 15 分钟；
(5)用移液器小心吸出上层水相，加入新的I. 5ml的离心管中，加入500 μ I的异丙醇(I: I体积)，充分混匀，室温沉淀IOmin ；
(6) 4°C, 12000rpm 离心 IOmin,小心弃去上清液；
(7) DNA沉淀用lml75%乙醇洗涤。4°C，8000rpm离心IOmin收集沉淀；
(8)重复用75%乙醇洗涤一次DNA沉淀；
(9)去上清，DNA沉淀于无菌操作台上晾干约10_15分钟，DNA略显透明，加入适当体积(30-50 μ I)的IOmM的Tris. HCl (ρΗ8. O)使沉淀溶解(可放于4°C冰箱溶解过夜)；
(10)紫外分光光度计及l%Agr0Se凝胶电泳检测DNA浓度及质量。
I. 2eIF(iso)4E. c的克隆及序列分析
(I)检索B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E.c基因全序列 (GenBank:HM131211. I)，在编码区上游和下游分别设计正反向引物，
PFl :5’GTTCGGAGAAGAGAAGACGGAG3’ ；
PRl :5’AAGATTACAGGCTTTTAAGGCC 3’，如 SEQ ID NO. 3,5 所示。
(2) PCR扩增在 20 μ I 反应体系中，包含 I X TransStart FastPfu buffer ;20ng 的基因组 DNA ;0· 4 μ M 正反向引物；O. 25mM dNTPmix; I 个单位的 TransStart FastPfu DNA 聚合酶(TransGenAP221)。PCR循环条件95°C预变性5分钟；接着是95°C变性30秒，57. 5°C 退火30秒，72 °C延伸40秒，35-38个循环，最后72°C延伸10分钟。
⑶PCR产物的电泳检测
PCR结束后，取10 μ IPCR扩增产物加入I μ IlOXloading buffer，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后EB染色，自动凝胶成像系统观察拍照。结果见图I。
(4) PCR产物的克隆测序
电泳确认目的条带被扩增后，取I μ I PCR扩增产物加I μ I pEasy-Blunt (TransGen CB101)载体室温连接10分钟，转化大肠杆菌感受态细胞 Transl-Tl (TransGen :CD501)，转化菌在含50 μ g/ml卡那霉素的LB固体平板上37°C倒置培养16小时左右。菌落PCR检测后挑取阳性克隆委托北京华大基因有限公司进行DNA序列的测定。
(5)所克隆的大白菜eIF(iso)4E. c序列分析
将来自TuMV抗性材料Hel02和感病材料06-247的BrA. eIF (iso) 4E. c基因组序列分别于已知的来自R-0-18的BrA. eIF (iso) 4E. c进行比较，发现来自TuMV敏感材料06-247 的BrA. eIF(iso)4E. c基因组序列与R-0-18的完全同源，将其命名为BrA. eIF(iso)4E. c，称为野生型；而来自TuMV抗性材料He 102的BrA. eIF (iso) 4E. c缺失了四个碱基，我们将其命名为BrA. eIF(iS0)4e. C，称为突变体，其序列如SEQ ID NO. 7所示，二者差异部分如图2所/Jn ο
I. 30RF预测及氨基酸顺序推导
(I)从GenBank 中检索得到 R-0-18 中同源基因的 0RF。用 NCBI 的 Splign (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/sutiIs/spIign/spIign. cgi textpage = online&level=form)工具，分析 BrA. eIF(iso)4e. c 的 0RF，其序列如 SEQ ID NO. 8 所示。
(2)对其ORF进行序列比对，发现差异部分恰好位于外显子区域，如图2所示。氨基酸的推导用DNAMAN软件进行，结果发现四个碱基的缺失导致移码突变和翻译产物的提前终止。野生型编码产物有200个氨基酸，而突变体编码产物只有117个氨基酸，其翻译产物的氨基酸顺序如SEQ ID NO. 9所示，其与正常编码产物的区别如图3所示，图中可见，突变体缺失了 N端90个氨基酸。实施例2共显性ASM标记的开发由于BrA. eIF(iso)4E. c和BrA. eIF(iso)4e. c的基因组序列存在四个碱基的插入/缺失突变，而突变位点两侧的核酸序列的保守性不强，据此我们采用巢式PCR策略扩增该突变位点，首先用扩增基因组序列的一对引物(PFl和PRl)进行首轮PCR扩增，再于突变位点两侧设计内侧嵌套引物PF2和PR2 (如SEQ ID NO. 4，6所示)，以第一次PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR扩增条件如I. 2第(2)条所示。扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离和硝酸银染色，染色程序参照张 春雷等[张春雷，佟广香，匡友谊，张超，尹家胜.微卫星产物变性与非变性PAGE-银染方法比较.水产学杂志.2010，23 (I) 11-14]的方法。结果将野生型和突变体很好地区分开来，结果如图4所示。该标记为共显性标记，其中与野生型有关的标记是ASM-W，片段大小128bp，其序列如SEQID NO. I所示；与突变体有关的标记为ASM_m，片段大小124bp，其序列如 SEQ ID NO. 2 所示。实施例3 ASM标记对大白菜组合He 102 X 06-247的F2群体鉴定(1)F2群体各单株基因组DNA提取如I. I所述。(2) PCR扩增PCR反应液的配制及扩增条件如I. 2第⑵条所述。(3) PCR产物的检测如实施例2所述。检测结果如图5所示，PI是亲本I，即06-247，P2是亲本2，即Hel02A，l-21是21个F2代单株。从图中可以看出6、11、12、15、17和20同亲本I，是野生型，而10、16同亲本2，是突变体，其余单株为杂合型。由此可见采用巢式PCR策略，通过两次PCR扩增，对鉴定eIF (iso) 4E. c位点的野生型、碱基缺失突变型及杂合型的准确率达100%。
权利要求
1.一种大白菜eIF(iso)4E. c位点碱基缺失突变的特异性分子标记,其特征在于与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小128bp，如SEQ ID No. I所示；对应的碱基缺失突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小124bp，如SEQ ID No. 2所示。
2.权利要求I所述的大白菜eIF(is0)4E.c位点碱基缺失突变的特异性分子标记的引物，其特征在于引物序列如下 正向引物 PFl :5’-CGAAGAAGAATATGGCGACAGA-3’ ；PF2 :5’-ACATTCACATGTTCAAAGCTGGTGTT-3’ ； 反向引物 PRl :5’-CTATTCTCTTGCATTGTTTGAGCG-3’ ；PR2 :5’-AGTTTCAAGCCAAGCCTTGTCTAAAG-3’ ； 如 SEQ ID NO. 3、4、5、6 所示。
3.权利要求I所述的大白菜eIF(is0)4E.c位点碱基缺失突变的特异性分子标记在鉴别大白菜eIF(iso) 4E. c基因位点的基因型中的应用。
4.权利要求2所述的引物在鉴别大白菜eIF(is0)4E.c基因位点的基因型中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于具体应用方式为利用(PF1+PR1)组合和(PF2+PR2)组合这两套引物组合对待测个体的基因组DNA进行两次PCR扩增，检测扩增片段的大小，如果扩增出128bp的条带，则为野生型；扩出124bp的条带则为突变型；如果同时扩出两条带，则为杂合型。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述PCR扩增具体为在20μ I反应体系中，包含I XTransStart FastPfu buffer ;20ng的基因组DNA ;0· 4 μ M正反向引物；O. 25mMdNTPmix ；1 个单位的 TransStart FastPfu DNA 聚合酶； PCR循环条件95°C预变性5分钟；接着是95°C变性30秒，57. 5°C退火30秒，72°C延伸40秒，35-38个循环，最后72°C延伸10分钟。
全文摘要
本发明公开了一种与大白菜eIF(iso)4E.c野生型和碱基缺失突变体鉴定直接相关的位点特异性共显性ASM标记与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-W，片段大小128bp，如SEQ ID No.1所示；对应的碱基缺失突变位点检测相关的标记命名为ASM-m，片段大小124bp，SEQ ID No.2所示。本发明利用同源克隆技术发现了eIF(iso)4E.c位点的一个突变体并开发了鉴定该位点的分子标记。利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择。同时该标记还可用于对大白菜种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料。
文档编号C12Q1/68GK102925437SQ20121045527
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者刘栓桃, 赵智中, 卢金东, 张志刚, 李巧云 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所