专利名称：一种ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株及其构建方法。
背景技术：
神经系统变性疾病是一类疾病，包括帕金森、阿尔茨海默等疾病，目前尚无有效、特异疗法，干细胞移植替代疗法具有良好的前景。移植入体内干细胞来源的神经元必须能与宿主神经系统存留的神经元之间建立有功能的突触联系，才能恢复突触信息的传递。目前的多种研究只是在形态学方面提供了间接证据，尚未在功能上尤其是传递信息的突触层
面阐明该问题。光遗传学技术的发展可以解决该问题。利用遗传学技术使细胞表达光敏感蛋白，可实现对细胞功能的光学控制，斯坦福大学的Deisseroth教授等将这种结合光学和遗传学结合的技术称为光遗传学技术。光敏感蛋白是能够被光激活的一类膜蛋白，广泛分布于原核生物、植物以及动物的视觉系统中，目前在光控神经元研究中广泛应用的是光敏感蛋白(Channelrhodopsin-2,简称ChR2)。ChR2是从单细胞绿藻中分离出来的一种感光性膜表达阳离子通道蛋白，能够通过基因转染技术表达在神经元的细胞膜上，当在低能量470nm蓝光瞬间(5-15ms)照射下，ChR2通道打开，Na+、Ca2+等阳离子进入胞内引起细胞去极化从而产生动作电位，而且不会影响神经元生物活性，因此是目前最常用的光敏感蛋白。通过基因转染，使干细胞同时稳定表达ChR2_GFP，其中GFP (绿色荧光蛋白，英文为green fluorescent protein,简称GFP)用于示踪干细胞,ChR2用于刺激细胞；移植入体内后，干细胞来源的神经元稳定表达ChR2和GFP，通过GFP示踪其位置，同时470nm激光光刺激表达ChR2的干细胞分化来源神经元细胞，同时通过膜片钳技术记录宿主神经元的突触后电流，研究移植干细胞来源的神经元与宿主神经元细胞的功能整合，为临床干细胞移植治疗变性疾病提供理论依据。然而，快速构建、筛选重组细胞株不是一件容易的事，提高重组基因工程化神经干细胞株的构建筛选效率也一直是重组干细胞实验的重要内容之一，一种好的构建、筛选方法可以节省大量的人力、物力，并加快科学研究的步伐。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种ChR2_GFP基因工程化神经干细胞株，所述细胞株为能稳定表达光敏感蛋白(channelrhodopsin-2, ChR2)和绿色突光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)的重组 C17. 2 神经干细胞株。本发明的另一目的是提供一种构建ChR2_GFP基因工程化神经干细胞株的方法，包括如下步骤第一步，重组慢病毒的构建和筛选接种293FT细胞于加有10%FBS+DMEM培养基的24孔板中，每孔细胞接种细胞数为I X IO5个，然后用慢病毒包装质粒混合物和ChR2-GFP慢病毒表达质粒共转染所述293FT细胞,24小时换为含1%FBS DMEM培养液，48小时5000rpm离心5min收集培养液上清，0. 45 u m的PVDF膜过滤所述上清得重组慢病毒液。以标准病毒液I X IO8Cfu / L为对照，将重组慢病毒液和标准病毒液按感染复数值分别设5个梯度1、3、5、10和20，感染293FT细胞并于24小时后根据绿色荧光细胞的强度和数量确定病毒滴度，当表达GFP的细胞超过95%、慢病毒液滴度达I. OX IO8Cfu / L的重组慢病毒液用于下一步实验。第二步，重组C17. 2神经干细胞株的构建和筛选C17. 2神经干细胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%马血清+DMEM培养基培养，在37°C、5%C02 6孔板细胞培养板培养细胞至50%融合时每孔更换Iml新的10%FBS (胎牛血清)+5%马血清+DMEM培养基，加入Iul所述重组慢病毒液，同时加入病毒感染辅助剂Polybrene使终浓度为8 u g/ml，转染6小时后，换为DMEM培养基培养至细胞80%_90%贴壁时以密度2X IO4 / ml传代至IOcm细胞培养皿中。在荧光显微镜下在所述IOcm细胞培养皿的底部标记表达GFP的细胞群，PBS清洗3遍后，将0. 05%胰酶-EDTA滴在剪成直径3mm的无菌滤纸片上，含有胰酶的滤纸片贴在已经标记GFP的细胞群上面，370C 3min后，将滤纸片加入新的含有10%FBS DMEM培养基的IOcm平皿中，终止消化，轻轻吹打，使黏附在滤纸片的细胞分散在平皿中，4天后，通过FACS分选出表达GFP 0.5%比率的细胞，并以I个细胞/孔的密度传至96孔板中。再通过免疫荧光双标检测和全细胞对光反应膜片钳鉴定获得重组ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株。本发明中，ChR2_GFP基因工程化神经干细胞株可以同时稳定表达ChR2_GFP，且可以稳定传代，并且470nm蓝光刺激能引起细胞产生内向电流。本发明方法构建重组干细胞，尤其是利用滤纸片消化法提高了 GFP阳性细胞的比率，有利于流式(FACS)分选，提高了实验效率。本发明的细胞株可用于移植干细胞分化来源的神经元与宿主神经系统功能整合的在体及离体研究，为干细胞移植后分化来源的神经元与宿主神经系统功能整合的研究提供一个良好的平台。
图I为本发明ChR2_GFP基因工程化神经干细胞株的光学显微镜图；图2为本发明免疫荧光双标检测ChR2_GFP基因工程化神经干细胞株表达ChR2-GFP蛋白和神经干细胞标记物Nestin蛋白的荧光图；图3为本发明全细胞对光反应膜片钳鉴定ChR2_GFP基因工程化神经干细胞株的对470nm蓝光刺激反应能力的电流具体实施例方式下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。本发明构建ChR2_GFP基因工程化神经干细胞株实验例第一步，重组慢病毒的构建和筛选接种293FT细胞于加有10%FBS+DMEM培养基的24孔板中，每孔细胞接种细胞数为I X IO5个，然后用慢病毒包装质粒混合物和ChR2-GFP慢病毒表达质粒(购买于Addgene公司)共转染293FT细胞；24小时换为含1%FBS DMEM培养液；48小时收集细胞，5000rpm离心5min, 0. 45 u m的PVDF膜过滤上清后用作待测病毒液(重组慢病毒液)；以标准病毒液IXlO8Cfu / L为对照，将待测病毒液和标准病毒液按感染复数值分别设5个梯度1、3、5、10和20，感染293T细胞并于24小时观察绿色荧光细胞的强度和数量以确定病毒滴度，将表达GFP的细胞超过95%，病毒液滴度达I. OX IO8Cfu / L的重组慢病毒液用于下一步实验。
第二步，转导C17. 2神经干细胞株，荧光活化细胞分选系统(fluorescenceactivated cell sorting,简称FACS)筛选稳转细胞株C17. 2神经干细胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%马血清+DMEM培养基培养，在37°C、5%C02 6孔板细胞培养板培养细胞至50%左右融合，首先换为lmllO%FBS (胎牛血清)+5%马血清+DMEM培养基，再取Iul (I.OX IO8Cfu / L)含有ChR2_GFP基因的慢病毒加入培养液 中，同时加入病毒感染辅助剂Polybrene(终浓度8iig / ml )，转染6小时后，换为正常DMEM培养基培养细胞，细胞长满后传代至IOcm细胞培养皿中(2X IO4 / ml)，同时在荧光显微镜下在IOcm平皿的底部标记表达GFP的细胞群，然后PBS清洗3遍，然后将0. 05%胰酶-EDTA(Gibco)滴在剪成直径3mm的无菌滤纸片上，含有胰酶的滤纸片贴在已经标记GFP的细胞群上面，37°C 3min后，将滤纸片加入新的含有10%FBS DMEM培养基的IOcm平皿中，终止消化，轻轻吹打，使黏附在滤纸片的细胞分散在平皿中，4天后，通过FACS分选出表达GFP 0. 5%比率的细胞，并以I个细胞/孔的密度传至96孔板中。FACS分选出的ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株的光学显微镜图如图I所示，呈单克隆样成长。将分选的细胞进行免疫荧光双标检测ChR2_GFP蛋白的表达，实验方法为a. ChR2-GFP的基因工程化干细胞以I X IO5 / ml的密度接种于预先放入灭菌的直径为12mm的圆玻璃爬片的24孔板内，用固定液4%多聚甲醛溶液固定，再弃固定液，PBS振洗 3 X5min。b.每孔加 200 V- I 4°C保存的 0. 1% triton,室温孵育 IOmin, PBS 振洗 3X5min。c.每孔加200 U I浓度为10%正常山羊血清工作液，室温孵育30min。d.吸去多余液体,加300 ii I含有1:200 Rabbit-anti_GFP—抗(碧云天生物技术研究所)和 1:300 Mouse-anti-Nestin (Abeam) 一抗，37°C孵育 Ih 后，4°C过夜。e.次日，PBS 振洗 3X5min。f.加入300 ill I 200的FITC-标记的山羊抗兔IgG和Cy3_标记的羊抗小鼠二抗，37°C孵育lh。g. PBS 振洗 3 X 5min。h. DAPI 染色后，PBS 振洗 3 X 5min。i. GVA水溶性封片剂封片，Olympus DP71数码显微照相机照相。免疫荧光双标检测ChR2_GFP蛋白的表达的荧光图如图2所示，蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为GFP蛋白即说明了 ChR2-GFP蛋白的表达，红色荧光为神经干细胞标记物Nestin蛋白的表达。由此说明成功获得ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株。将分选的细胞进行全细胞对光反应膜片钳鉴定对光反应能力，实验方法为在暗室内将细胞爬片置于灌流槽中，用室温下氧饱和的细胞外液灌流(l_2ml/min)。选择表面光洁、折光性强的细胞进行全细胞膜片钳实验，玻璃微电极拉制好并充灌适量的电极内液(葡萄糖酸钾 140mM, MgCl2 2mM, K2ATP2mM, EGTA I. ImM, HEPES 10mM)，调节微操纵器，使电极尖端接近细胞，利用特定的测试方波电脉冲形成封接，Giga欧(IO9 Q )封接完成后稳定Imin,轻轻吸破细胞膜，形成全细胞膜片钳模式，细胞稳定2min后，立即记录其静息膜电位(RMP)、膜电容(Cm)及膜阻抗。电压钳模式下将膜电位钳制在_25mV，同时给予470nm蓝光刺激，记录细胞对光反应电流。细胞对470nm蓝光刺激反应能力的电流图如图3所示，光反应电流最大可为150pA，也说明成功获得ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株，其特征在于所述细胞株为能稳定表达光敏感蛋白(ChR2)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组C17. 2神经干细胞株。
2.—种构建权利要求I所述的ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株的方法，其特征在于包括如下步骤 第一步，重组慢病毒的构建和筛选 接种293FT细胞于加有10%FBS+DMEM培养基的24孔板中，每孔细胞接种细胞数为I X IO5个，然后用慢病毒包装质粒混合物和ChR2-GFP慢病毒表达质粒共转染所述293FT细胞,24小时换为含1%FBS DMEM培养液，48小时5000rpm离心5min收集培养液上清，O. 45 μ m的PVDF膜过滤所述上清得重组慢病毒液。
以标准病毒液I X IO8Cfu / L为对照，将所述重组慢病毒液和标准病毒液按感染复数值分别设5个梯度1、3、5、10和20，感染293FT细胞并于24小时后根据绿色荧光细胞的强度和数量确定病毒滴度，当表达GFP的细胞超过95%、慢病毒液滴度达I. OX IO8Cfu / L的重组慢病毒液用于下一步实验。
第二步，重组C17. 2神经干细胞株的构建和筛选 C17. 2神经干细胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%马血清+DMEM培养基培养，在37°C、5%C026孔板细胞培养板培养细胞至50%融合时每孔更换Iml新的10%FBS (胎牛血清)+5%马血清+DMEM培养基，加入Iul所述重组慢病毒液，同时加入病毒感染辅助剂Polybrene使终浓度为8 μ g/ml，转染6小时后，换为DMEM培养基培养至细胞80%_90%贴壁时以密度2 X IO4 /ml传代至IOcm细胞培养皿中。
在荧光显微镜下在所述IOcm细胞培养皿的底部标记表达GFP的细胞群，PBS清洗3遍后，将O. 05%胰酶-EDTA滴在剪成直径3mm的无菌滤纸片上，含有胰酶的滤纸片贴在已经标记GFP的细胞群上面，37°C 3min后，将滤纸片加入新的含有10%FBS DMEM培养基的IOcm平皿中，终止消化，轻轻吹打，使黏附在滤纸片的细胞分散在平皿中，4天后，通过FACS分选出表达GFP O. 5%比率的细胞，并以I个细胞/孔的密度传至96孔板中。再通过免疫荧光双标检测和全细胞对光反应膜片钳鉴定获得重组ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株。
全文摘要
本发明公开了一种ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株及其构建方法，所述细胞株为能稳定表达光敏感蛋白(ChR2)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组C17.2神经干细胞株；通过构建重组慢病毒、转导C17.2神经干细胞株以及筛选获得重组ChR2-GFP基因工程化神经干细胞株；本发明的细胞株可用于移植干细胞分化来源的神经元与宿主神经系统功能整合的在体及离体研究，为干细胞移植后分化来源的神经元与宿主神经系统功能整合的研究提供一个良好的平台；本发明构建重组干细胞方法，尤其是利用滤纸片消化法，提高了GFP阳性细胞的比率，有利于流式FACS分选，大大提高了实验效率。
文档编号C12N5/10GK102978164SQ201210459119
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者王少军 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院