专利名称：一种筛选反硝化细菌的方法
技术领域：
本发明属于环境生物领域，具体涉及一种从人工湿地中筛选出的具有高降解率的反硝化细菌的方法。
背景技术：
长期以来，池塘养殖是我国淡水养殖业的中流砥柱，池塘养鱼产量占全国淡水水产品年总量的50%以上。但近几年，池塘养殖在发展中也遇到了不少的问题，如残饵、鱼、虾类排泄物、死亡藻类不断增多，底部有机物不断积淀，这些有机物在缺氧条件下，经发酵、分解产生大量的氨氮、硫化氢及亚硝酸盐等，当水中的氮、磷等元素达到一定数值后，引发池塘水体富营养化，从而会使池塘水质发生变化，PH值下降，水体中有益菌自净能力减弱，破坏水体微生物的平衡，严重影响鱼、虾类新陈代谢和生长发育，甚至导致其死亡。
我国池塘养殖水体环境的控制和修复的生态技术发展快速且多样化，如水生植物修复技术，生态浮床系统、微生态技术等，但是，微生态技术因使用方便、成本低廉、效果显著而被大家所采用。微生态技术是通过反硝化细菌的菌株的反硝化作用，还原水体中的亚硝酸盐，使之生成无害的氮气，解除亚硝酸盐的危害；消耗氮素营养，抑制藻类过度繁殖，净化水体。从人工湿地中筛选、分离出的反硝化细菌的菌株在池塘养殖的微生态系统中稳定性较强，对养殖水体中的氨氮、亚硝态氮的分解效果较好，投入成本低，同时也为养殖环境的生物修复奠定理论了基础。
发明内容
本发明的目的是从人工湿地中筛选出一株具有高降解效率的反硝化细菌，并对其进行筛选和分离纯化，然后应用在池塘养殖中，达到降低亚硝酸盐、净化塘内水体的效果。为了实现以上技术效果，本发明是通过如下步骤包括本发明所用的初筛反硝化细菌的菌源来自中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所池塘生态工程研究中心，室外人工垂直潜流湿地表层往下30厘米处取得的滤料与水的混合样。该人工湿地主要用于净化处理池塘养殖废水并循环利用。一种筛选反硝化细菌的方法，其步骤包括(I)反硝化细菌的富集培养将人工湿地中初筛得到的反硝化细菌菌源与培养基混合后摇床培养；再将摇床培养得到的菌悬液置于富集培养基中富集培养，得到反硝化细菌菌液；(2)反硝化细菌菌株的固体培养将步骤(I)中的反硝化细菌菌液接种于平板分离基上，然后将平板分离基置于25°C -30°C条件下划线培养，直至菌落生长良好；(3)挑取步骤(2)中得到的反硝化菌株的斜面菌种接种于活化培养基中摇床培养，再用无菌生理盐水离心洗涤并稀释后冷藏备用。所述步骤(I)中，反硝化细菌菌源和培养基按照体积比为I : 10进行混合后摇床培养7-10天，培养温度为30°C，旋转转速为75转/分钟所述步骤⑴中，富集培养基的组成包括以下比例的原料柠檬酸钠、MgSO4 · 7H20、K2HPO4 · 3H20、KNO3、KH2PO4及蒸馏水的用量比为5. Og O. 2g l.Og 2.0 I. Og lOOOmL，所述富集培养基的 pH 值为 7. 2 7. 5，121°C条件下灭菌15分钟所述步骤(2)中，平板分离基为营养琼脂，分离基的pH为7. 0-7. 2，121°C条件下灭菌15分钟。所述步骤(3)中，摇床培养温度为25°C -30°C，培养培养时间为18_25小时，将离心洗涤后的菌株用无菌生理盐水稀释至OmL菌液并在0°C -4°C条件下保存。
所述反硝化细菌的鉴定方法，步骤包括(a)将步骤(3)中得到的备用反硝化细菌菌液按照10%的接种量，接种于养殖废水中，28°C -32°C条件下摇床培养24小时；(b)在摇床培养过程中，每隔2小时取样I次,每次取样量为10mL，并测定样品中氨氮、亚硝态氮含量。本发明的有益效果是本发明的反硝化菌株的是从人工湿地中初筛得到的，再经过进一步的培养、筛选，成为一株对于亚硝态氮降解能力极强的反硝化细菌菌株，然后按照10%的接种量接种于养殖废水中，该废水在菌液接种三小时后水中的亚硝态氮的含量降低了 75%以上，所以应用在池塘养殖中能很好的起到净化水体、抑制藻类过度繁殖的效果。所述反硝化细菌的菌株在池塘养殖的微生态系统中稳定性较强，投入成本低。
图I为本筛选方法得到的反硝化细菌的菌落图。图2为本筛选方法得到的反硝化细菌接种于养殖废水中，亚硝态氮含量的变化。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明考虑到人工湿地滤料上的截留物中微生物种类丰富且和养殖水体和底质环境相似，所以考虑将滤料截留的悬浮物作为功能菌筛选的基础培养基。将滤料上的原始微生物群落作为筛选对象，经过连续的摇瓶培养和不断转接富集之后，筛选出适应于高有机质底质和亚硝态氮浓度并具有高效降解效果的菌群。具体方法如下I、反硝化细菌的分离培养从人工湿地表层往下30厘米处取滤料与水的混合样，此处为人工湿地的厌氧环境，有利于筛选出厌氧菌群。采样点分布在人工湿地中部，采三个样混合后4°C条件下冷藏。取冷藏的混合样中的上层混合样，将此混合样分成两部分，一份为筛选菌群，另一份为培养基，培养基放在高压灭菌锅内高压灭菌15分钟，然后4°C条件冷藏备用。将未灭菌的泥水混合样按10 : I与无菌水混合，制成菌源。将菌源和培养基按照体积比例为I : 10进行混合后摇床培养7天，培养温度为30°C，旋转转速为75转/分钟，然后再转接三次后得到反硝化细菌的菌悬液。2、反硝化细菌的富集培养将上述步骤中得到的反硝化细菌的菌悬液接种于富集培养基中培养1-2周。所用的富集培养基由5.(^柠檬酸钠、0.281%504 · 7H20、1.0gK2HPO4 · 3Η20、2· Og ΚΝ03、1· Og KH2PO4及IOOOmL蒸馏水组成，所述富集培养基的pH值为7. 2 7. 5，121°C条件下灭菌15分钟。3、反硝化细菌菌株的固体培养首先制作平板分离培养基，按照营养琼脂瓶上的配方，称取32g营养琼脂置于IOOOmL的三角瓶中，并加入离子水搅拌溶解，在搅拌的同时用pH计测定培养基的pH值，用NaOH溶液和HCl溶液调节培养基的pH值，使pH值在7. 0-7. 2之间，并进行灭菌处理。
然后倒平板趁热将营养琼脂培养基倒平板(无菌操作)，平放，待营养琼脂凝固后备用。最后，将经过富集培养的反硝化细菌菌液作为培养对象划线培养。吸取反硝化细菌菌液IOOuL置于已做好标记的平板中，待菌悬液都吸取完以后，再用经过灭菌的L型涂布棒涂抹菌液。平板全部涂抹好以后，置于工作台中，待菌液蒸发稍干后，倒置平板于培养箱中培养。所用培养箱为生物培养室二氧化碳培养箱，设定温度为30°C，2天后观察记录菌落的形态、颜色等菌落的生长情况。再经过多次平板分离与纯化，得到相对优势的菌株。所得菌株的形态为乳白色、边缘光滑、培养基中不透明、液体为透明。所得菌落形态图如图I所
/Jn ο4、挑取上述反硝化细菌菌株的斜面菌种接种于活化培养基中摇床培养，摇床培养18-20小时后，再用无菌生理盐水离心洗涤3次、最后用生理盐水稀释成菌液，4°C冷藏备用。5、反硝化细菌的降解效果鉴定将制得的反硝化细菌菌液按照10%的接种量，接种于养殖废水中，28°C _32°C条件下摇床培养24小时。在摇床培养过程中，每隔2小时取样I次，每次取样量为10mL，并测定样品中氨氮、亚硝态氮含量。以时间为横坐标，氨氮、亚硝态氮含量为纵坐标作图，具体结果如图2所示。图2中，对照组为不加反硝化细菌菌液的养殖废水中的亚硝态氮含量值，实验组为加了本筛选方法得到的反硝化细菌菌液的养殖废水中亚硝态氮值，通过两组数值对比后，养殖废水在菌液接种三小时后水中的亚硝态氮的含量降低了 75%以上，降解效果明显，而且降解速度较快。
权利要求
1.一种筛选反硝化细菌的方法，其步骤包括 (1)反硝化细菌的富集培养将人工湿地中初筛得到的反硝化细菌菌源与培养基混合后摇床培养；再将摇床培养得到的菌悬液置于富集培养基中富集培养，得到反硝化细菌菌液； (2)反硝化细菌的固体培养将步骤(I)中的反硝化细菌菌液接种于平板分离基上，然后将平板分离基置于25°C -30°C条件下培养，直至菌落生长良好； (3)挑取步骤(2)中得到的反硝化菌株的斜面菌种接种于活化培养基中摇床培养，再用无菌生理盐水离心洗涤并稀释后冷藏备用。
2.根据权利要求I所述的一种筛选反硝化细菌的方法，其特征在于所述步骤(I)中，反硝化细菌菌源和培养基按照体积比为I : 10进行混合后摇床培养7-10天，培养温度为30°C，旋转转速为70 80转/分钟。
3.根据权利要求I所述的一种筛选反硝化细菌的方法，其特征在于所述步骤(I)中，富集培养基的组成包括以下比例的原料柠檬酸钠、MgSO4 · 7H20、K2HPO4 · 3H20、KNO3、KH2PO4及蒸馏水的用量比为5. Og O. 2g l.Og 2.0 l.Og lOOOmL，所述富集培养基的pH值为7. 2 7. 5，121°C条件下灭菌15分钟。
4.根据权利要求I所述的一种筛选反硝化细菌的方法，其特征在于所述步骤(2)中，平板分离基为营养琼脂，分离基的PH为7. 0-7. 2，121°C条件下灭菌15分钟。
5.根据权利要求I所述的一种筛选反硝化细菌的方法，其特征在于所述步骤(3)中，摇床培养温度为25°C _30°C，培养培养时间为18-25小时，将离心洗涤后的菌株用无菌生理盐水稀释并在0°C -4°C条件下保存。
6.一种如权利要求I所述的筛选反硝化细菌的方法，其特征在于所述反硝化细菌的鉴定方法包括以下步骤 (a)将步骤(3)中得到的备用反硝化细菌菌液按照10%的接种量，接种于养殖废水中，28 0C -32 °C条件下摇床培养24小时； (b)在摇床培养过程中，每隔2小时取样I次，每次取样量为10mL，并测定样品中氨氮、亚硝态氮含量。
全文摘要
本发明属于环境生物领域，具体涉及一种从人工湿地中筛选具有高降解率的反硝化细菌的方法，首先将人工湿地中初筛得到的反硝化细菌菌源与培养基混合后摇床培养，再将摇床培养得到的菌液置于富集培养基中富集培养，得到反硝化细菌菌液；然后将反硝化细菌菌液接种于平板分离基上，然后将平板分离基置于25℃-30℃条件下培养，直至菌落生长良好；最后上述挑取反硝化菌株的斜面菌种接种于活化培养基中摇床培养，再用无菌生理盐水离心洗涤、稀释后冷藏备用。本发明筛选得到的反硝化细菌菌株，对于废水中亚硝态的降解能力强，降解速度快。而且该菌株在池塘养殖的微生态系统中的稳定性较强，投入成本低。
文档编号C12N1/20GK102965313SQ201210466988
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月17日 优先权日2012年11月17日
发明者朱浩, 顾兆俊, 刘兴国 申请人:中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所