专利名称：蜡状芽孢杆菌kmsr88 及其接种剂和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蜡状芽孢杆菌KMSR88及其接种剂和应用，具体涉及一种能有效分解纤维素及生长温度广谱的蜡状芽孢杆菌KMSR88及其堆肥接种剂和应用，属环境微生物技术领域。
背景技术：
水葫芦，又名凤眼莲，属雨久花科水葫芦属，是一种原产于南美洲的多年生浮水植物。水葫芦生性喜光，适应于热带、亚热带气候(27-30°C为最佳生长温度)，生长速度快， 在适合条件下，每五日生物量即可增加一倍；单位生物量大，每公顷水面可达200万株，合 300-400吨；忍耐力极强，不论是在贫营养，还是在富营养湖泊、水库，甚至在高酸性和高碱性水体中，水葫芦都能存活(盛婧等，2010)。近年来，随着我国许多水体富营养化程度的加剧，水葫芦的分布面积有不断增大的趋势，其在江河、湖泊、水库大面积覆盖常见报道，因此，水葫芦在我国资源丰富。由于水葫芦大面积覆盖，易造成水体溶解氧降低、生物多样性减少、水上交通堵塞等不良影响，每年南方很多地区都需要积极采取措施对其进行打捞防除，但是水葫芦被打捞后往往直接丢弃，造成严重的二次污染和资源浪费(刘红江等2011 )。
研究证明，水葫芦具有较高的利用价值。Gajalakshmi and Abbasi (2002)研究结果表明，利用水葫芦混合堆肥生产的绿肥，对植物的生长产生明显的促进效果，而且是安全可行的。Murugesan等以水葫芦、稻草为原料栽培食用菌，结果表明，水葫芦处理的收益显著高于稻草处理。通过水葫芦的转化利用来减少水葫芦数量，使之变废为宝，是控制水葫芦水体危害及二次污染的良好途径。已有的研究表明，水葫芦是钾含量最高的水生植物之一 (Reddy et al.，1991 ；周文兵等，2004)，全株干基钾含量能够达到5%以上，水葫芦也具有较强的氮吸收能力，氮含量可达3%。由此可见，水葫芦植株是极好的养分资源。而且，在水葫芦众多处置措施中，水葫芦农田施用是最为经济有效、环境友好、操作简单的一种处理方式。由于到水葫芦打捞和作物生长在时间上可能存在的不同步性，水葫芦常被简易堆制成有机肥施用。作为补充土壤钾的良好措施，水葫芦有机肥在农田施用在我国南方发展潜力巨大。随着滇池水葫芦种植面积的扩大，水葫芦渣的产生量也急剧增加。水葫芦渣的处理与处置已成为限制利用水葫芦去除滇池中的富营养化的限制条件之一。水葫芦渣堆肥与其他处理方法，如填埋、焚烧相比，具有建设投资少，运行费用低，基本无二次污染等优点。并且， 水葫芦渣经堆肥处理后能土地利用，充分利用其有机质和氮、磷等营养元素，是适合我国国情的处置方式。但是，堆肥工厂化的发展一直受到因堆肥时间和场地带来的成本问题的困扰，堆肥的快速化具有重要的现实意义。
水葫芦渣堆肥接种已成为提高堆肥质量和发酵效率的重要手段之一。目前，已有多种微生物被应用于堆肥接种。但这些菌株大多分解水葫芦有机质能力不强，并不是从水葫芦渣中分离而得，为中温菌，主要的作用体现在促进堆肥起温方面，但当堆温达到 45-50°C以上时，不能继续有效发挥降解的作用，使有机物的分解效率下降，无害化效果较差，影响堆肥腐熟。因此，迫切需要寻找一类既能在中温、又能在高温的条件下，代谢有机物的温度广谱性微生物，并且，把这类微生物接种到堆肥中，在堆肥的中温期和高温期利用有机物进行生长代谢，促进迅速达到高温期及维持较长的时间，实现水葫芦渣的快速腐熟，减少进一步的环境污染，降低成本，缩短生产发酵时间。
本发明涉及一种生长温度广谱的蜡状芽孢杆菌KMSR88及其应用，能在水葫芦渣堆肥处理中加快腐熟过程和纤维素分解。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
参考文献
[I] Reddy K. R. , Agami M. , D，Angelo E. M. , Tucker J. C, Influence of K supply on growth and nutrient storage of water hyacinth. Bioresource Technol, 1991，37 (I) 79 - 84
[2]刘红江，陈留根，朱普平，盛婧，张岳芳，郑建初，农田施用水葫芦对水稻干物质生产与分配的影响，应用与环境生物学报，2011，17(4) =521-526
[3]盛婧，陈留根，朱普平，周炜，薛新红，高养分富集植物水葫芦的农田利用研究，中国生态农业学报，2010，18 (I) 46-49
[4]谢建昌，周建民，Harder R.钾与中国农业.南京河海大学出版社，2000 : 105-106
[5]周文兵，刘大会，朱端卫，不同调理剂对猪粪堆肥过程及其养分状况的影响， 华中农业大学学报，2004，23 (4) 421 - 42
发明内容
本发明的目的在于提供一种腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus)KMSR88及其接种剂和应用。
本发明的目的是这样实现的
本发明菌株KMSR88是从采自昆明神瑞农业有限公司堆肥发酵车间腐熟的水葫芦堆肥样品中分离筛选得到的一株在中高温范围均能代谢有机物质进行生长，并且具有良好分解纤维素能力的蜡状芽孢杆菌菌株，该菌株已于2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCjia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏号 CGMCC No. 6596。
本发明菌株KMSR88具有如下特性KMSR88菌株菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，I. O 1.2X3. O 5. O微米。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，I. O I. 5微米。革兰氏阳性，无荚膜，运动。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。菌落形态在普通琼脂平板培养基上，37 °C，培养24 h，形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5-7 mm.在MSP培养基上生长更旺盛，菌落直径达8_10 mm，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。在蛋白胨酶母膏平板上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大。
含有蜡样芽孢杆菌KMSR88的接种剂，经如下步骤得到
(I)、菌种活化取蜡样芽孢杆菌KMSR88的菌种接种于LB液体培养基胰蛋白胨 10g/L，酵母萃取物 5g/L，NaCl 10g/L, ρΗ7· O 中，在 30-37 °C 条件下培养 3_5d ；
(2)、发酵种子液制备将活化的菌种接种于LB液体培养基中进行一级扩大培养，当培养液0D_在大于I. 5时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比8%接种至LB液体培养基中进行二级扩大培养，当培养液OD6tltl在大于2. 6时停止培养，得发酵种子液；一级、二级培养条件均为30-37°C，转速为120-180r/min，培养时间为5_7d ；
(3)、接种剂的制备在含水量为40%_50%的稻壳堆中添加尿素和蔗糖，24h后， 再在稻壳堆中均匀泼洒麸皮、玉米粉和发酵种子液进行堆置发酵，期间翻堆，至温度稳定在环境温度时，停止发酵，将发酵产物干燥，制得接种剂；其中
a.尿素和蔗糖的添加方法为分别按稻壳干重质量比O. 5%和2%称取尿素和蔗糖，将尿素和蔗糖与水按重量比1:20配成溶液，均匀泼洒稻壳堆中；
b.麸皮、玉米粉和发酵种子液的添加方法为将按稻壳堆干重1%的麸皮、2%的玉米粉和2%的步骤(2)得到的发酵种子液混合，混拌均匀后泼洒在稻壳堆中，稻壳堆体高度O. 6-1. Sm，占地面积〈50m 2，盖上透气性覆盖物进行堆置发酵；
c.当发酵温度达到60_65°C并持续36_48h后，进行第I次翻堆，以后按第I次翻堆的条件再翻堆4-8次，直到温度稳定在环境温度后，将发酵产物在45-55°C下烘干6h， 得固态接种剂。
3、权利要求2所述的接种剂按堆肥总干重的8%_10%应用于水葫芦渣堆肥中。
本发明的优点在于
I、蜡样芽孢杆菌KMSR88能较好的分解纤维素，并能在广谱性温度生长；将其制成接种剂用于水葫芦渣堆肥中，能促进纤维素的分解，快速起温，迅速进入堆肥高温阶段 (500C以上)并维持较长的高温(50-70°C )，促进水葫芦渣脱水和高温灭菌，加快水葫芦渣的腐熟进程，提高堆肥的质量和发酵效率。
2、蜡样芽孢杆菌菌株KMSR88效果明显，无害、无环境造成污染具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于大面积水域种植的水葫芦渣堆肥中。
图I显示接种和灭活处理堆肥后的温度变化。
具体实施例方式
实施例所用的设备均为市场销售的通用设备。
实施例I :蜡样芽孢杆菌KMSR88的分离与纯化
称取昆明神瑞农业有限公司堆肥发酵车间的水葫芦渣堆肥腐熟的样品有机肥0.5 g,加入大约20 mL无菌水，混勻,使样品悬浮，取悬浮液I mL接种到含100 mL液体种子培养基的250 mL摇瓶中，45° CU80 r/min培养5 d。取I mL培养液梯度稀释至102、104、IO6UO8涂布于固体培养基上47° C培养2 d。挑取平板上菌落饱满、透明圈明显的单个菌落接种于液体培养基中，47° CU80 r/min再培养2 d。重复液体培养和固体平板分离3次。)，挑取生长旺盛的单菌落，在细菌培养基上，反复划线分离纯化3次， 再将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜下观察菌体形态，多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，接种至细菌斜面培养至丰厚，在4°C下保存，备用。将初筛得到的单菌株进行纤维素分解鉴定和不同温度活性实验，最终筛选出一株在40°C 70°C下能同时有效分解纤维素的温度广谱性菌株KMSR88。
实施例2 :菌株KMSR88的鉴定
生理生化特征菌株的生理和生化特征实验测定方法及鉴定，革兰氏染色结果表明，菌株KMSR88为革兰氏阳性。菌株KMSR88能在多种碳源中生长，能利用葡萄糖、 果糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖作为唯一碳源进行生长；其接触酶反应阳性，氧化酶反应阳性。根据《伯杰细菌鉴定手册》，其特征与芽孢杆菌属细菌较为相似。菌株KMSR88的 16S rRNA基因序列分析采用PCR技术，成功扩增出菌株KMSR88的16SrRNA基因，然后克隆和测序。测定的序列长度为1370 bp，获得的16S rRNA基因序列通过GENBANK数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)进行比对,结果显示相似性在99%以上的菌株均为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的菌株，把该菌株编号命名为KMSR88，并于 2012年9月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为 Bacillus cereus，保藏号 CGMCC No. 6596。
实施例3 :蜡样芽孢杆菌KMSR88分解纤维素活性测定
将实菌株蜡样芽孢杆菌KMSR88菌株在无菌环境中接种至培养基(胰蛋白胨IOg/ L，酵母萃取物5g/L，NaCl 10g/L, pH7. O)上，在37°C下培活化养3天，然后在无菌环境中，用接种针挑取一环KMSR88，接种至装有600ml已灭菌的细菌培养基中，在180rpm，37°C 下振荡培养3天，得发酵液。发酵液经4000 r/min离心10 min,上清液作为粗酶液。用0.5 mL适当稀释的酶液于70° C恒温水浴预热2 min后，加入1.5 mL用醋酸缓冲液 pH 4. 8配制的1%羧甲基纤维素钠溶液，70° C恒温水浴酶解30 min,加入I mL浓度为I mol/L的氢氧化钠摇匀以终止反应。然后加入2 mL的DNS于沸水浴中5 min,用流动的冷水终止反应，冷却后在540 nm下测定其吸光值，并对照标准曲线后测算酶活力。结果显示产酶的菌株KMSR88所产生的纤维素酶40°C 70°C下，相对酶活力较高，达到85% 100%。在此温度范围之外，相对酶活力较低。
实施例4 :接种剂的制备
含有蜡样芽孢杆菌KMSR88的接种剂，经如下步骤得到
(I)、菌种活化取蜡样芽孢杆菌KMSR88的菌种接种于LB培养基胰蛋白胨IOg/ L，酵母萃取物5g/L，NaCl 10g/L, pH7. O中，在30°C或37°C条件下培养3d或5d ;
(2)、发酵种子液制备将活化的菌种接种于LB液体培养基中进行一级扩大培养， 当培养液0D_在大于I. 5时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比8%接种至LB液体培养基中进行二级扩大培养，当培养液OD6tltl在大于2. 6时停止培养，得发酵种子液；一级、 二级培养条件均为30°C或37°C，转速为120 r/min或150 r/min或180r/min，培养时间为 5d 或 7d ;
(3)、在含水量为40%或50%的稻壳堆中添加尿素和蔗糖，24h后，再在稻壳堆中均匀泼洒麸皮、玉米粉和发酵种子液进行堆置发酵，期间翻堆，至温度稳定在环境温度时， 停止发酵，将发酵产物干燥，制得接种剂；其中
a.尿素和蔗糖的添加方法为分别按稻壳干重质量比O. 5%和2%称取尿素和蔗糖，将尿素和蔗糖与水按重量比1:20配成溶液，均匀泼洒稻壳堆中；
b.麸皮、玉米粉和发酵种子液的添加方法为将按稻壳堆干重1%的麸皮、2%的玉米粉和2%的步骤(2)得到的发酵种子液混合，混拌均匀后泼洒在稻壳堆中，稻壳堆体高度O. 6 m或I. 2m或I. 8m,占地面积〈50m2，盖上透气性覆盖物进行堆置发酵；
c.当发酵温度达到60或65°C并持续36h或42h或48h后，进行第I次翻堆，以后按第I次翻堆的条件再翻堆4-8次，直到温度稳定在环境温度后，将发酵产物在45°C或 55°C下烘干6h，得固态接种剂。
实施例5 :接种剂的应用和效果
将实施例4中制备的接种剂按堆肥总干重的8%或10%的接种量接种于水葫芦渣堆肥中，并以灭活的该堆肥接种剂为对照，以草炭为辅料，调节碳氮比为25，含水率56%，进行堆肥，堆肥周期为22天，每天测定堆肥温度，当堆肥温度上升至60°C并持续24小时后进行翻堆，翻堆后继续发酵，直至物料均为灰黑褐色时，物料发酵成熟。从图I可见，与灭活对照比，实施例54的堆肥接种剂接菌处理在第2天就超过了 50°C，使堆肥高温期(大于 500C )提前；接菌处理的最高温度比灭活对照高19°C(接菌处理53°C ;灭活对照34°C)， 接菌处理的高温期比灭活对照长6天(接菌处理16天；灭活对照10天)。说明本接种剂用于水葫芦渣堆肥中，能促进纤维素有机物的降解，使堆体快速起温，迅速进入堆肥高温阶段(50°C)并维持较长的高温(50-70°C)，效果明显，无害、无环境造成污染。试验结果显示本发明提供的蜡样芽孢杆菌KMSR88制得的接种剂能够使堆体快速起温，迅速进入高温阶段，并维持长时间高温，有利于有机物的快速降解和腐熟进程，提高了堆肥的质量和发酵效率。
权利要求
1.蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus) KMSR88，其保藏编号为 CGMCC No. 6596。
2.含有权利要求I所述蜡样芽孢杆菌KMSR88的接种剂，其特征在于该接种剂经如下步骤得到(1)、菌种活化取蜡样芽孢杆菌KMSR88的菌种接种于LB液体培养基胰蛋白胨IOg/ L，酵母萃取物5g/L, NaCl 10g/L, pH7. O中，在30_37°C条件下培养3_5d ;(2)、发酵种子液制备将活化的菌种接种于LB液体培养基中进行一级扩大培养，当培养液0D_在大于I. 5时停止培养，得一级种子；将一级种子按体积比8%接种至LB液体培养基中进行二级扩大培养，当培养液OD6tltl在大于2. 6时停止培养，得发酵种子液；一级、二级培养条件均为30-37°C，转速为120-180r/min，培养时间为5_7d ；(3)、接种剂的制备在含水量为40%-50%的稻壳堆中添加尿素和蔗糖，24h后，再在稻壳堆中均匀泼洒麸皮、玉米粉和发酵种子液进行堆置发酵，期间翻堆，至温度稳定在环境温度时，停止发酵，将发酵产物干燥，制得接种剂；其中a.尿素和蔗糖的添加方法为分别按稻壳干重质量比O.5%和2%称取尿素和蔗糖，将尿素和蔗糖与水按重量比1:20配成溶液，均匀泼洒稻壳堆中；b.麸皮、玉米粉和发酵种子液的添加方法为将按稻壳堆干重1%的麸皮、2%的玉米粉和2%的步骤(2)得到的发酵种子液混合，混拌均匀后泼洒在稻壳堆中，稻壳堆体高度 O. 6-1. Sm，占地面积〈50m2，盖上透气性覆盖物进行堆置发酵；c.当发酵温度达到60-65°C并持续36-48h后，进行第I次翻堆，按照前述方法再翻堆 4-8次，直到温度稳定在环境温度后，将发酵产物在45-55°C下烘干6h，得固态接种剂。
3.权利要求2所述的接种剂按堆肥总干重的8%-10%应用于水葫芦渣堆肥中。
全文摘要
本发明涉及蜡状芽孢杆菌KMSR88及其接种剂和应用，属环境微生物技术领域。本发明的内容包括蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus) KMSR88，其保藏编号为CGMCC No.6596。含有蜡样芽孢杆菌KMSR88的接种剂经菌种活化、发酵种子液制备、及接种剂的制备步骤得到。接种剂按堆肥总干重的8%-10%应用于水葫芦渣堆肥中。本发明的优点在于蜡样芽孢杆菌KMSR88能较好的分解纤维素，并能在广谱性温度生长；将其制成接种剂用于水葫芦渣堆肥中，能促进纤维素的分解，快速起温，迅速进入堆肥高温阶段(50℃以上)并维持较长的高温(50-70℃)，促进水葫芦渣脱水和高温灭菌，加快水葫芦渣的腐熟进程，提高堆肥的质量和发酵效率。具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于大面积水域种植的水葫芦渣堆肥中。
文档编号C12N1/20GK102925396SQ20121047511
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者余磊, 赵建荣, 张懿萱 申请人:昆明学院, 昆明神瑞农业投资有限公司