专利名称：一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用。
背景技术：
金针 免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory protein from flammulinavelutipes，FIP-fve)是从金针菇中分离获得的非特异性免疫增强剂，对机体免疫具有双向调节作用，具有免疫调节、抗癌症、抗过敏等活性，特别是通过调节体内细胞因子含量和维持平衡的角度起到预防和治疗过敏症的目的，具有副作用小、标本兼治的优势。作为不含糖基的小分子单纯蛋白质，金针菇免疫调节蛋白方便操作与应用，是非常有前景的可应用于临床的药用蛋白，因此将其开发成抗过敏产品造福人类很有必要。但由于金针菇生产周期长，天然FIP-fve含量极微，产率不足90mg/kg，且分离成本极高，所以通过其他生物反应器生产该蛋白是其走上应用的有效途径。目前国内外几家研究机构也对其进行了原核和真核表达，但是普遍存在原核表达率低、多数形成不溶性的包涵体或可溶性蛋白所占比例较小，不能形成正确的二级结构或以不溶性的包涵体形式存在，需要变性复性处理影响生物活性，不适合开发应用。真核表达虽然有较高的表达率和能形成糖基化结构，但是发酵工艺复杂、成本高、细胞培养诱导表达蛋白时采用甲醇等有害试剂、操作繁琐，而且表达蛋白糖基化程度过高，与天然蛋白不符，结构不确定，产物不纯，有多种不同的形式，活性难以稳定，另外因没有纯化标签，纯化工艺复杂，成本过高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有金针菇免疫调节蛋白工程菌株表达率低，表达产物多为不溶性的包涵体，结构不确定以及菌体破碎率低、纯化工艺复杂不适合大规模生产应用的一个或多个问题，而提供一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用。本发明的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株包含有插入了编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA的大肠杆菌表达质粒pET30a ( + )，使得获得的重组表达质粒在转化到Transetta (DE3)大肠杆菌中时能够表达金针菇免疫调节蛋白。本发明的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的构建方法，是按照以下步骤进行的一、采用试剂盒提取金针菇总RNA ；二、以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒进行RT-PCR，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的cDNA ；三、将步骤二得到的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a ( + )中，得到重组载体pET30a ( + ) -FIP-fve连接产物；四、将步骤三获得的重组载体pET30a( + )-FIP_fve连接产物转入Transetta (DE3)大肠杆菌中，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株。本发明的获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株金针菇免疫调节蛋白的方法，是按照以下步骤进行的将获得的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株，将上述工程菌株培养到OD6tltl为O. 8 I. 0，然后加入IPTG诱导金针菇免疫调节蛋白表达，最后分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；其中，所述的IPTG终浓度为O. Γ0. 5mM或O. 5 ImM。本发明所获得的金针菇免疫调节蛋白在制备用于预防或治疗过敏症的药物中的用途。本发明包含以下有益效果与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少(产量为5mg/L，KO JL etal.，1997)或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程(“孔祥辉等，2007”)相比，本发明的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的 tRNA 的高表达基因工程菌株 Transetta (DE3)。本发明的可溶性重组蛋白表达率为菌体总蛋白的40%以上，比以往的表达率仅为22%左右(张介驰等，2007)提高80%以上，产量为45mg/L以上，比2009年徐贵雪等用pET_28构建的表达载体生产的重组蛋白产量(30mg/L)提高了 50%以上。本发明使用溶菌酶(作用浓度O. lmg/mL)结合超声波法(作用时间20min)使菌体破碎率达到98%以上，比单用溶菌酶(作用浓度O. lmg/mL，破碎率28%)和单用超声波法(作用时间20min，破碎率40%)提高30%以上，并节约了成本；经圆二色谱测定表达蛋白二级结构，含15%的α-螺旋和38%的β折叠，比例接近天然蛋白，这是本发明的蛋白具有更好生物活性的结构基础，更具有开发应用价值。并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了 6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3 4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本发明为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。本发明构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。
图I为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体酶切后的电泳图；I为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体酶切后得到的pET30a(+)和目的片段图(箭头所指为目的片段)；2 为重组 pET30a(+)-FIP-fve 表达载体；M 为 DNA Marker DL2000 ；M I 为 DNA Markerλ -HINDUI ；图2为能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株诱导后表达产物SDS-PAGE电泳分析图(20%SDS-PAGE);其中，I 为 Marker 蛋白质 Mr 标样 Protein Ruler I (Lot#E10408TransGenBiotect), 12kD(2. O μ g/5 μ L), 20kD(O. 5 μ g/5 μ L), 30kD(O. 5 μ g/5 μ L), 40kD(I O μ g/5 μ L)，60kD (O. 5 μ g/5 μ L)，80kD (O. 5 μ g/5 μ L) ；2 为重组 pET30a (+) -FIP-fve 表达载体转化Transetta(DE3)菌株未诱导电泳图；3为pET30a_FIP-fve转化Transetta(DE3)菌株的蛋白诱导表达I. 5h后的电泳图；4为pET30a-FIP-fve转化Transetta(DE3)菌株的蛋白诱导表达3. Oh后的电泳图；5为pET30a-FIP_fve转化Transetta(DE3)菌株的蛋白诱导表达4. 5h后的电泳图；图3为不同浓度的IPTG在温度为21°C的条件下诱导表达重组载体pET30a(+ ) -FIP-fve可溶性蛋白的蛋白电泳图；其中，M为蛋白Marker Protein RulerI (Lot#E10408 TransGenBiotect), 12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(O. 5 μ g/5 μ L), 30kD(O. 5 μ g/5 μ L)，40kD (I. O μ g/5 μ L)，60kD (O. 5 μ g/5 μ L)，80kD (O. 5 μ g/5 μ L) ; I 为 O. 2mM 的 IPTG诱导蛋白表达后的条带；2为O. 5mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；3为I. OmM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；图4为不同浓度的IPTG在温度为28°C的条件下诱导表达重组载体pET30a(+ )-FIP-fve 蛋白的蛋白电泳图；其中，M 为蛋白 Marker Protein Ruler I (Lot#E10408TransGen Biotect)，12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L), 40kD (I. 0 μ g/5 μ L), 60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L) ; I 为 0. 2mM 的 IPTG 诱导蛋白表达后的条带，2为O. 5mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带，3为I. OmM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；图5为不同浓度的IPTG在温度为37°C的条件下诱导表达重组载体pET30a(+ )-FIP-fve 蛋白的蛋白电泳图；其中，M 为蛋白 Marker Protein Ruler I (Lot#E10408TransGen Biotect)，12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L), 40kD (
I.0 μ g/5 μ L), 60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L) ; I 为 0. 2mM 的 IPTG 诱导蛋白表达后的条带，2为0. 5mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带，3为I. OmM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；图6为重组金针菇免疫调节蛋白表达、菌体裂解方法比较及纯化前后SDS-PAGE电泳结果图；1为溶菌酶+超声波裂解；2为未亲合蛋白液；3为表达菌液；4为溶菌酶裂解；5为漂洗部分；6为前洗脱的目的蛋白；7为后洗脱的目的蛋白；MSProtein Marker ProteinRuler I(Lot#E10408 TransGen Biotect),12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L)，40kD (I. 0 μ g/5 μ L)，60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L)；图7为重组金针菇免疫调节蛋白表达及柱层析纯化前后SDS-PAGE电泳结果图；其中，I为未未和蛋白；2为漂洗部分3为表达囷液裂解蛋白；4为洗脱目的蛋白；图8为圆二色谱测定的重组蛋白的二级结构图，其中，I为基线，2为计算值，3为测量值。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株包含有插入了编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA的大肠杆菌表达质粒pET30a( + )，使得获得的重组表达质粒在转化到Transetta (DE3)大肠杆菌中时能够表达金针燕免疫调节蛋白。本实施方式包含以下有益效果与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少(产量为5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程(“孔祥辉等，2007”)相比，本实施方式的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的 tRNA 的高表达基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了 6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3 4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本实施方式为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。本实施方式构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。
具体实施方式
二 本实施方式的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的构建方法，是按照以下步骤进行的一、采用试剂盒提取金针菇总RNA ；二、以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒进行RT-PCR，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的cDNA ；三、将步骤二得到的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a ( + )中，得到重组载体pET30a ( + ) -FIP-fve连接产物；四、将步骤三获得的重组载体pET30a( + )-FIP_fve连接产物转入Transetta (DE3)大肠杆菌中，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株。本实施方式包含以下有益效果与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少(产量为5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程(“孔祥辉等，2007”)相比，本实施方式的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的 tRNA 的高表达基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了 6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3 4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本实施方式为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。本实施方式构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤三中所述的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a ( + )中操作步骤为将步骤一获得的金针菇免疫调节蛋白编码cDNA以及表达载体pET30a(+)采用BamH I和EcoR I进行双酶切，酶切后纯化回收金针菇免疫调节蛋白编码cDNA与表达载体pET30a(+)，然后采用连接酶进行连接，得到重组载体pET30a ( + )-FIP-fve连接产物。其它与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
四本实施方式获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株金针菇免疫调节蛋白的方法，是按照以下步骤进行的按照具体实施方式
二的方法获得的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株，将上述工程菌株培养到0D_为O. 8 I. 0，然后加入IPTG诱导金针菇免疫调节蛋白表达，最后分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；其中，所述的IPTG 终浓度为 O. Γ0. 5mM 或 O. 5 ImM。本实施方式包含以下有益效果与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少(产量为5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程(“孔祥辉等，2007”)相比，本实施方式的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的 tRNA 的高表达基因工程菌株 Transetta (DE3)。本实施方式的可溶性重组蛋白表达率为菌体总蛋白的40%以上，比以往的表达率仅为22%左右(张介驰等，2007)提高80%以上，产量为45mg/L以上，比2009年徐贵雪等用pET-28+构建的表达载体生产的重组蛋白产量(30mg/L)提高了 50%以上。本发明使用溶菌酶(作用浓度O. lmg/mL)结合超声波法(作用时间20min)使菌体破碎率达到98%以上，比单用溶菌酶(作用浓度O. lmg/mL，破碎率28%)和单用超声波法(作用时间20min，破碎率40%)提高30%以上，并节约了成本；经圆二色谱测定表达蛋白二级结构，含15%的α -螺旋和38%的β折叠，比例接近天然蛋白，这是本实施方式的蛋白具有更好生物活性的结构基础，更具有开发应用价值。并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了 6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3 4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本实施方式为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。本实施方式构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规CN 102925403 A
书
明
说
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模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四不同的是所述的金针菇免疫调节蛋白序列如序列表Seq ID No:2所不。其它与具体实施方式
四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
四或五不同的是所述的分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白的操作步骤包括一、取按照具体实施方式
二的方法获得的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株，按体积比为1:1(Γ200的比例接种于LB液体培养基中，加入终浓度为O. OflmM的IPTG，然后在温度为8°C 37°C，转速为8(T280rpm/min的条件下诱导培养12 48h ；二、取步骤一诱导培养后的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株菌液，在转速为100(Tl5000rpm/min的条件下，离心O. 5 lOmin，收集沉淀，然后将收集的沉淀重悬于10^200倍重量的PBS缓冲液中，得菌悬液；三、向步骤二得到的菌悬液中加入终浓度为O. riOmg/mL的溶菌酶，在温度为30 37°C条件下孵育5 30min，得菌液；四、将步骤三中得到的菌液置于冰浴中，在超声功率为20W 200W，间隔时间f 30s的条件下，超声处理l 50min ；五、将步骤四超声处理的菌液在温度为4°C，转速为500(Tl5000rpm/min的条件下，离心I 30min,收集上清液采用Ni-His Band柱层析,然后采用Sephadex G25凝胶层析柱方法进行脱盐，用O. 02M、pH为7. 8的PBS进行洗脱，即获得纯化的表达蛋白溶液，完成分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白。其它与具体实施方式
四或五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
四至六之一不同的是步骤二中所述的PBS缓冲液pH为8. O。其它与具体实施方式
四至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
四至七之一不同的是步骤五中所述的采用Ni-His · Band柱层析，所用的Wash缓冲液为含有浓度为50mM咪唑基的Wash缓冲液、所用的洗脱缓冲液成分为500mM的咪唑、O. 5M的NaCl，20mM的Tris-HCl ;其中，洗脱缓冲液PH为7. 9。其它与具体实施方式
四至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式所获得的金针菇免疫调节蛋白在制备用于预防或治疗过敏症的药物中的用途。本实施方式包含以下有益效果与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少(产量为5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程(“孔祥辉等，2007”)相比，本实施方式的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的 tRNA 的高表达基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了 6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3 4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本实施方式为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。
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本实施方式构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
九不同的是制备用于预防或治疗过敏症的药物的方法，包括将具体实施方式
四得到的金针菇免疫调节蛋白与可药用载体混合，即制得用于预防或治疗过敏症的冻干粉针药物；其中，可药用载体为甘露醇或右旋糖酐，添加量为39Γ6%。其它与具体实施方式
九相同。通过以下试验验证本发明的有益效果试验I本试验的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的构建及其蛋白表达纯化一、能够表达金针菇免疫调节蛋白基因的提取采用TaKaRa公司的RNAisoforPolysaccharide-rich Plant Tissue试剂盒提取白B品种(由黑龙江省科学院微生物研究所提供)的金针菇总RNA ；二、能够表达金针菇免疫调节蛋白基因的PCR扩增以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒(购买自TaKaRa公司)进行RT-PCR，得扩增产物，将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用Agarose Gel DNA Purification Kit(购买自TaKaRa公司)进行纯化回收，获得了金针菇免疫调节蛋白基因；将金针菇免疫调节蛋白基因进行测序，序列提交GenBank获得序列号为⑶388420. I，该序列与报道的FIP-fve基因的序列同源
100%(K0 JL et al.，1997)，重组蛋白His-FIP-fve的开放读码框为510bp(如序列表SeqID No 1所示)，其编码170个氨基酸(如序列表Seq ID No 2所示)，分子量为18780kDa ；三、重组表达载体pET30a ( + ) -FIP-fve的构建a、表达载体pET30a ( + )的DNA提取取I. 5mL活化培养表达载体pET30a ( + )的菌液，离心收集菌体，悬浮于O. 35mL的STET裂解液中，加入25 μ L新配制的溶菌酶，振荡混合3s，将反应管置于沸水浴40s，立即取出然后离心lOmin，用牙签从管中取出沉淀，向上清液中加入40 μ L浓度为2. 5mol/L的醋酸钠溶液和420 μ L的异丙醇，快速混合后，在_70°C温度下静置15min后，取出置于4°C，以12000r/min转速离心lOmin，弃上清液，收集沉淀加入ImL质量百分含量为70%的乙醇，然后在4°C温度下，以12000r/min转速离心2min，收集沉淀进行干燥，将干燥后的沉淀溶于50 μ L的TE中，贮存于-20°C，待用；b > BamH I 和 EcoR I 双酶切将步骤二得到的金针菇免疫调节蛋白基因，以及步骤a得到的表达载体pET30a(+)分别进行BamH I和EcoR I双酶切；其中，金针菇免疫调节蛋白基因酶切反应条件先加入BamH I在30°C温度下，酶切I. Oh后，再加入EcoR I在37°C温度下，酶切I. 0h，然后将酶切的金针菇免疫调节蛋白基因在65°C水浴进行酶灭活lOmin，然后采用饱和酚试剂抽提，取上层液体，加入3倍体积预冷的(T4°C无水乙醇，在4°C温度下放置Ih后，在转速为12000r/min的条件下离心15min，收集沉淀，沉淀用质量百分含量为75%预冷乙醇洗涤一次，然后离心，再用灭无菌水溶解，得到酶切后的金针菇免疫调节蛋白基因，将其连接到同样酶切并纯化的pET30a( + )质粒(购买自 Amersham Pharmacia Biotech 公司)上，构建重组质粒 pET30a ( + )-FIP-fve。其中，pET30a ( + )质粒的酶切纯化反应为将表达载体pET30a(+)先加入BamH I在30°C温度下，酶切I. Oh后，再加入EcoR I在37°C，酶切I. Oh，向反应液中加入3倍体积的DB Buffer (购买自TaKaRa公司)均勻混合,转移至Spin Column (购买自TaKaRa公司)中，在转速为12000r/min的条件下，离心lmin，收集滤液，然后加入Spin Column中重复离心I次，弃滤液，收集沉淀；分别用500 μ L的Rinse A (购买自TaKaRa公司)和700 μ L的RinseB(购买自TaKaRa公司)清洗,然后在转速为12000r/min的条件下离心30s,弃滤液，收集沉淀；在3 111 Column膜的中央处加入25 μ L温度为60°C的灭菌蒸馏水，室温静置lmin，然后在转速为12000r/min的条件下离心lmin，洗脱酶切后的pET30a ( + )质粒。C、连接将步骤b酶切后的pET30a ( + )质粒和金针菇免疫调节蛋白基因，按目的片段载体=5:1摩尔比混合，在T4DNA连接酶的作用下，在16°C连接反应24h，得到重组载体pET30a(+ )-FIP-fve连接产物；四、金针菇免疫调节蛋白基因工程重组菌株的构建通过热激转化法将pET30a_FIP-fve 转入 Transetta (DE3)大肠杆菌(购买自 TransGen Biotech 公司，商品编号⑶801)中，取0. OOflmL的转化培养物涂于含50 μ g/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，在37°C温箱中培养过夜，同时取另外两管不含重组子的培养物分别涂于含50 μ g/mL卡那霉素的LB琼脂平板和不含卡那霉素的LB琼脂平板上作对照，次日观察各平板中菌落的生长情况，若对照平板中含50 μ g/mL卡那霉素的LB琼脂平板未长菌落，不含卡那霉素的LB琼脂平板上长有菌落，则取涂转化菌的含50 μ g/mL卡那霉素的LB琼脂平板长出的单菌落接种于5mL的LB培养基中，置于37°C空气浴摇床振荡培养过夜，即得金针菇免疫调节蛋白基因工程重组菌株；五、阳性重组子的筛选、鉴定及表达鉴定d、重组载体 pET30a ( + ) -FIP-fve 的 PCR 鉴定取IyL步骤四得到的金针菇免疫调节蛋白基因工程重组菌株，用灭菌去离子水稀释500 1000倍后，取I μ L做模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下
权利要求
1.能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株，其特征在于能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株包含有插入了编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA的大肠杆菌表达质粒pET30a( + )，使得获得的重组表达质粒在转化到Transetta (DE3)大肠杆菌中时能够表达金针燕免疫调节蛋白。
2.构建如权利要求I所述的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的方法，其特征在于所述的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的构建方法是按照以下步骤进行的一、采用试剂盒提取金针菇总RNA；二、以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒进行RT-PCR，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的cDNA ；三、将步骤二得到的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a(+ )中，得到重组载体pET30a ( + ) -FIP-fve连接产物；四、将步骤三获得的重组载体pET30a( + ) -FIP-fve连接产物转入Transetta (DE3)大肠杆菌中，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株。
3.根据权利要求2所述的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的构建方法，其特征在于步骤三中所述的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a ( + )中操作步骤为将步骤一获得的金针菇免疫调节蛋白编码cDNA以及表达载体pET30a(+)采用BamH I和EcoR I进行双酶切，酶切后纯化回收金针菇免疫调节蛋白编码cDNA与表达载体pET30a(+)，然后采用连接酶进行连接，得到重组载体pET30a( + )-FIP_fVe连接产物。
4.获得如权利要求I所述的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的方法是按照以下步骤进行的按照权利要求2的方法获得的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株，将上述工程菌株培养到OD6tltl为O. 8 I. 0，然后加入IPTG诱导金针菇免疫调节蛋白表达，最后分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；其中，所述的IPTG终浓度为O. Γ0. 5mM或O.5 ImM。
5.根据权利要求4所述的获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于所述的金针菇免疫调节蛋白序列如序列表Seq ID No :2所/Jn ο
6.根据权利要求4获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于所述的分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白的操作步骤包括一、取按照权利要求2的方法获得的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株，按体积比为1:10^200的比例接种于LB液体培养基中，加入终浓度为O. OflmM的IPTG，然后在温度为80C 37°C，转速为8(T280rpm/min的条件下诱导培养12 48h ；二、取步骤一诱导培养后的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株菌液，在转速为100(Tl5000rpm/min的条件下，离心O. 5 lOmin，收集沉淀，然后将收集的沉淀重悬于10^200倍重量的PBS缓冲液中，得菌悬液；三、向步骤二得到的菌悬液中加入终浓度为O.riOmg/mL的溶菌酶，在温度为3(T37°C条件下孵育5 30min，得菌液；2四、将步骤三中得到的菌液置于冰浴中，在超声功率为20W 200W，间隔时间l 30s的条件下，超声处理l 50min ；五、将步骤四超声处理的菌液在温度为4°C，转速为500(Tl5000rpm/min的条件下，离心I 30min,收集上清液采用Ni-His · Band柱层析,然后采用Sephadex G25凝胶层析柱方法进行脱盐，用O. 02M、pH为7. 8的PBS进行洗脱，即获得纯化的表达蛋白溶液，完成分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白。
7.根据权利要求6所述的获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于步骤二中所述的PBS缓冲液pH为8. O。
8.根据权利要求6所述的获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于步骤五中所述的采用Ni-His Band柱层析,所用的Wash缓冲液为含有浓度为50mM咪唑基的Wash缓冲液、所用的洗脱缓冲液成分为500mM的咪唑、O. 5M的NaCl, 20mM的Tris-HCl ;其中，洗脱缓冲液pH为7. 9。
9.如权利要求4所述的获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于所获得的金针菇免疫调节蛋白在制备用于预防或治疗过敏症的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的获得的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株金针菇免疫调节蛋白在制备用于预防或治疗过敏症的药物中的用途，其特征在于制备用于预防或治疗过敏症的药物的方法，包括将权利要求4得到的金针菇免疫调节蛋白与可药用载体混合，即制得用于预防或治疗过敏症的冻干粉针药物；其中，可药用载体为甘露醇或右旋糖酐，添加量为3%飞％。
全文摘要
一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用，它涉及一种重组菌株的构建、表达纯化及其应用。本发明要解决现有金针菇免疫调节蛋白工程菌株表达率低，表达产物多为不溶性的包涵体，结构不确定以及菌体破碎、纯化工艺复杂不适合大规模生产应用的问题。本发明将金针菇免疫调节蛋白基因，以Transetta(DE3)作为宿主菌，构建重组菌株；再用IPTG诱导表达，通过溶菌酶法结合超声法处理后采用Ni-His·Band柱层析，Sephadex G25凝胶层析柱方法脱盐，即完成重组菌株的构建及表达纯化。其用于制备预防或治疗过敏症的药物。其纯化过程简单而快速，适于规模化发酵生产。
文档编号C12N1/21GK102925403SQ201210475139
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者孔祥辉, 张介驰, 张丕奇, 戴肖东, 韩增华, 马庆芳, 刘佳宁, 党阿丽 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所