专利名称：利用一种新的转运信号来实现外源蛋白质的分泌表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中实现外源蛋白质分泌表达的新方法。更特殊地涉及枯草芽孢杆菌分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸作为转运信号来实现外源蛋白质的分泌表达。
背景技术：
由于枯草芽孢杆菌具有非致病性、蛋白质分泌能力强、遗传特性清楚等优点。因此近年来以枯草芽孢杆菌为宿主实现外源蛋白质表达弓I起人们的广泛关注。枯草芽孢杆菌没有外膜，分泌蛋白质直接被释放到细胞外，因此枯草芽孢杆菌是实现外源蛋白质分泌表达的理想宿主。在枯草芽孢杆菌中主要存在四种蛋白质分泌途径Sec分泌途径、Tat分泌途径、ABC转运子途径和Com途径。超过90%的分泌蛋白质是通过Sec途径被转运到细胞外； Tat途径的特点是分泌在胞内折叠成正确构象的蛋白质；ABC途径仅转运细菌素等多肽分子；Com途径参与细胞质感受态的形成。然而令人失望的是大量的外源蛋白质分泌量极低，一些细胞质蛋白质(如乳糖酶LacZ、耐热乳糖酶BgaB、氯霉素乙酰转移酶Cat)即使加上信号肽仍不能分泌到细胞外。因此，发现新的能实现外源蛋白质分泌表达的方法尤为重要。通过二维电泳分析枯草芽孢杆菌的分泌蛋白质组(secretome)表明17种无信号肽蛋白质大量的存在于细胞外。由于这些分泌蛋白质不含有信号肽而且不是通过已知的分泌途径分泌到细胞外，因此这些蛋白质被称作非经典分泌蛋白质(non-classicalIysecreted proteins)。分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag是枯草芽孢杆菌中分泌量最大的三种非经典分泌蛋白质。这些蛋白质为分泌表达外源蛋白质提供了一种新的可能。本发明是以细胞质蛋白质耐热乳糖酶BgaB为报告蛋白质，通过融合非经典分泌蛋白质的N端部分而实现BgaB的分泌表达。
发明内容
本发明的目的以分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸作为转运信号来实现外源蛋白质的分泌表达。本发明所采用的技术方案是枯草芽孢杆菌作为转运信号来实现外源蛋白质的分泌表达。具体的，是利用枯草芽孢杆菌分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸编码序列作为转运信号，分别与外源目的蛋白质(BgaB)的编码基因进行融合，构建能够融合表达重组蛋白的质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，从而实现融合蛋白质的分泌表达。本发明选择分子伴侣GroEL的前50个氨基酸(GroEL50，GeneID :938045)、烯醇酶Eno前50个氨基酸(Eno50, GeneID :938641)和鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸(Hag50, GeneID 936742)作为融合标签，选择易检测的细胞质蛋白质BgaB为外源基因，以具有转化能力且遗传学特性清楚的枯草芽孢杆菌菌株作为重组质粒的转化菌株，如Bacillus subtilisl68及其衍生菌株。
本发明涉及分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(GroEL50、Eno50和Hag50)，将这些片段的编码基因分别与外源目的蛋白基因的编码序列融合后构建成重组质粒 pMA5-GroEL50-BgaB、pMA5-Eno50-BgaB 和 pMA5-Hag50_BgaB，这些质粒中含有强启动子Hpall、融合片段的编码基因以及外源目的蛋白基因(BgaB)，它可在枯草芽孢杆菌中表达融合蛋白。本发明涉及的构建的融合表达重组蛋白的重组质粒转化枯草芽孢杆菌后得到的重组菌株，组成型的表达融合蛋白质，可通过酶活活性或者蛋白质电泳检测发酵上清液中的外源蛋白质。本发明中的空白对照是把BgaB基因直接连接到中性蛋白酶NprE的信号肽(ssNprE)上而构成的重组质粒pMA5-ssNprE-BgaB。耐热乳糖酶的酶活以测定水解邻硝基苯-β -D-半乳吡喃糖苷(oNPG)产生黄色的邻硝基苯在420nm下的吸光值。乳糖酶酶活单位U定义为在pH6. 5，55°C条件下，每分钟水解产生I μ mo I的oNP所需的酶量为一个乳糖酶活单位U。
groEL-F ATTCCATATGGCAAAAGAAATTAAGTTTAGT
groEL50-R CCGGAATTCATTTGTGATTAACGGAGAACCeno-F ATTCCATATGCCATACATTGTTGATGTTTATGCeno50-R ACCGGAATTCCTCAACCGCTTCGTATTCACCTGhag-F AGTGCATATGAGAATTAACCACAATATTGChag50-R CTGGAATTCTTCAGAGATCGCAAGACCTG与本领域已知的方法相比，本发明是成功的利用了分子伴侣GroEL和鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸作为转运信号分泌表达了外源蛋白质，而且分泌量极高。虽然烯醇酶Eno的前50个氨基酸作为转运信号能引导外源蛋白质至细胞外，但分泌量极少。阴性对照在细胞外检测不到外源蛋白质。
图I融合表达GroEL50-BgaB重组质粒pMA5-Hag50_BgaB构建流程图。GroEL50为分子伴侣GroEL的前50个氨基酸编码片段，BgaB是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001 (Bacillus stearothermophiIus IAM11001)耐热半乳糖苷酶(乳糖酶)编码基因。Promoter HpaII是组成型强启动子HpaII。图2融合表达Eno50-BgaB重组质粒pMA5-Eno50_BgaB构建流程图。Eno50为烯醇酶Eno的前50个氨基酸编码片段，BgaB是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001 (BacillusstearothermophiIus IAM11001)耐热半乳糖苷酶(乳糖酶)编码基因。Promoter HpaII是组成型强启动子HpaII。图3融合表达Hag50_BgaB重组质粒pMA5_Hag50_BgaB构建流程图。Hag50为鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸编码片段，BgaB是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌IAMl 1001 (BacillusstearothermophiIus IAM11001)耐热半乳糖苷酶(乳糖酶)编码基因。Promoter HpaII是组成型强启动子HpaII。图4蛋白质电泳检测不同时间点的BgaB胞内和胞外的蛋白质量。菌体经超声波破碎后用三氯乙酸法(TCA法)浓缩10倍后上样，发酵上清液经TCA浓缩10倍后直接上样，上样量均为10 μ Lo图八中，1-5是61*(^1^0-88&8融合蛋白质在611、911、1211、1511、1811时胞内蛋白质样品;6-10是Eno50-BgaB在6h、9h、12h、15h、18h时胞内蛋白质样品;11_15是！^50-88&8在611、911、1211、1511、1811时胞内蛋白质样品。图B中，1-5是对应时间点的GroEL50-BgaB蛋白质的发酵上清样品；6_10是对应时间点的Eno50_BgaB蛋白质的发酵上清样品；11_15是对应时间点的Hag50-BgaB蛋白质的发酵上清样品。箭头所指为带有融合标签的BgaB蛋白质。图5WB800 (pMA5-GroEL50-BgaB)和 WB800 (pMA5-ssNprE-BgaB)的生长和酶活曲线。图中 GroEL50 和 ssNprE 表示 WB800 (pMA5-GroEL50-BgaB)和 WB800 (pMA5-ssNprE-BgaB)的生长曲线；GroEL50酶活和ssNprE酶活表示发酵上清液中GroEL50_BgaB50和ssNprE-BgaB 的酶活。
具体实施例方式I. GroEL50、Eno50 和 Hag50 编码序列的获得 按照细菌基因组快速提取试剂盒说明书提取B. subtilisl68菌株基因组DNA。根据已发表的Bacillus subtilis 168全基因组序列设计相应引物，在上游和下游引物中分别引入NdeI和EcoRI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。以基因组DNA为模板，PCR扩增相应的编码序列，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，大小与预期相符。扩增用的聚合酶是东洋纺(上海)生物科技有限公司的KODplus。引物序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。groEL-F ATTCCATATGGCAAAAGAAATTAAGTTTAGTgroEL50-R CCGGAATTCATTTGTGATTAACGGAGAACCeno-F ATTCCATATGCCATACATTGTTGATGTTTATGCeno50-R ACCGGAATTCCTCAACCGCTTCGTATTCACCTGhag-F AGTGCATATGAGAATTAACCACAATATTGChag50-R CTGGAATTCTTCAGAGATCGCAAGACCTG克隆得到的PCR产物进行产物纯化，_20°C保存备用。2.质粒的构建通过采用NdeI和EcoRI双酶切PCR产物GroEL50、Eno50和Hag50，经胶回收后克隆于经相同酶切的pMA5-ssNprE-BgaB的质粒中(由实验室保藏，构建过程可参考王双辉，王光强，陈海琴等.信号肽对耐热β_半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中表达的影响
.[2010-09-27].中国科技论文在线)，分别得到质粒 pMA5-GroEL50-BgaB、pMA5-Eno50-BgaB和pMA5-Hag50_BgaB。构建的质粒经测序验证正确。3.重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定采用电击法将重组质粒分别转化枯草芽孢杆菌WB800菌株中(2. 0kv，lmm，电击I次，时间常数=4. 5 5. 0ms，Gene Pulser Xcell)，涂布含卡那霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接种至5mL含终浓度为50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基。收集菌体并按照细菌基因组快速提取试剂盒说明书提取基因组DNA，通过PCR验证重组质粒是否转化成功。阳性克隆分别命名为WB800 (PMA5-GroEL50-BgaB)、WB800(pMA5-Eno50-BgaB)和 WB800(pMA5-Hag50-BgaB)。
4.枯草芽孢杆菌重组菌株中GFP的检测把重组菌株接种于5ml的LB液体培养基中，37°C培养,培养不同时间分别取样。IOOOOrpm离心15min收集菌体，然后用PBS洗涤三次，并重悬于等体积的PBS重悬菌体。然后加入终浓度为5mg/mL的溶菌酶，37°C水浴保温lh，利用超声波破碎菌体(2min，300W，Sonic, VCX500)。利用TCA方法浓缩10倍，具体是在样品中加入1/10体积的70% (v/v)三氯乙酸，在室温放置5分钟，13000转离心15分钟，然后用冰冷的80%丙酮洗涤2次，吹干，然后用1/10样品体积的上样缓冲液重悬，取10μ L用来做蛋白质电泳分析。BgaB的酶活测定取100 μ L发酵上清液和900 μ L磷酸盐缓冲液滴入一支离心管中，混合，调温至55°C。加5. OmL oNPG底物溶液，振摇。精确IOmin后加2. OmL碳酸纳溶液，使反应终止。室温静置5min,随后用分光光度计(420nm)测定吸光度。空白对照时将100 μ L发酵上清液和900 μ L磷酸盐缓冲液和2. OmL碳酸钠混合，然后再加5. OmL底物溶液，室温静置5min后测定吸光值。oNPG底物溶液底物的配置称取250mg oNPG，用20mM的磷酸盐缓冲液(pH6. 5)定容到IOOmL0
本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中实现外源蛋白质分泌表达的新方法。以分子伴侣GroEL和鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸作为转运信号实现了外源蛋白质BgaB的分泌表达，而且分泌量极高。虽然烯醇酶Eno的前50个氨基酸作为转运信号也能引导外源蛋白质至细胞外，但分泌量极少。它的发现对于实现外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌表达表达提供了新的可能。
权利要求
1.以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisl68)分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸,实现外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，利用分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸作为融合标签，与外源目的蛋白基因融合，构建融合表达载体，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌，从而实现外源蛋白质的分泌表达。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，外源目的蛋白基因为编码具有生物活性的蛋白或酶。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的重组质粒是将枯草芽孢杆菌分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag的编码序列与外源目的蛋白基因融合得到的质粒，重组质粒中含这些蛋白质的前50个氨基酸编码片段、氨苄青霉素和卡那霉素的抗性选择标记基因、组成型强启动子HpaII和外源目的蛋白质的编码基因，构建的质粒转化枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌带有游离型质粒，含有融合标签的重组菌株的能实现外源蛋白质的分泌表达。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)分子伴侣GroEL、烯醇酶Eno、鞭毛蛋白质Hag的前50个氨基酸，实现外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的新方法，具体是把转运信号融合到外源蛋白质的氨基端从而实现外源蛋白质的分泌表达。
文档编号C12N15/75GK102925475SQ20121047679
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者陈卫, 王光强, 宋元达, 陈海琴 申请人:江南大学