专利名称：一种重组乙型脑炎病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组乙型脑炎病毒及其应用，特别涉及甲基转移酶缺陷型乙型脑炎病毒及其应用。
背景技术：
乙型 脑炎病毒，又称日本脑炎病毒，属于黄病毒科黄病毒属成员，主要由库蚊叮咬传播，临床上可以引起严重的脑炎和神经系统疾病。乙型脑炎主要流行于东南亚地区，致死率高达30%，且约30-50%的患者留下严重的后遗症。据世界卫生组织估计，亚洲地区每年乙型脑炎患者超过16000例，死亡人数超过5000，对人类健康和公共卫生构成严重威胁。而且，近些年来乙型脑炎已蔓延到其他的地区，如巴基斯坦，澳大利亚等国家。它的高致死性及区域扩散性严重危及人类健康，已引起国际社会的广泛关注。目前，对流行性乙型脑炎无有效治疗方法，只能通过疫苗接种进行预防。世界范围内主要有三种乙型脑炎疫苗用于临床，包括原代地鼠肾细胞灭活疫苗，Vero细胞灭活疫苗及原代地鼠肾细胞减毒活疫苗(SA14-14-2)，其中VeiO细胞灭活疫苗主要在美国、欧洲等发达国家使用，后两种疫苗主要应用于印度、中国等发展中国家。乙型脑炎病毒的基因组为长10，976nt的单股正链RNA，包括5'和3'的非编码区及单一开放读码框。该读码框编码3种结构蛋白衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体/膜蛋白(PrM/M)和包膜糖蛋白(E)及7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。病毒基因组的5'末端有帽子结构，但3'末端无polyA尾巴。非结构蛋白NS5是其基因组编码的最大的蛋白质，在病毒基因组复制和调控宿主抗病毒反应过程中发挥关键作用。NS5蛋白是一种多功能蛋白，具有RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase, RdRp)和甲基转移酶(methyltransferase, MTase)活性。其中竣基端约 600个氨基酸残基为RdRp活性区，主要负责病毒基因组RNA的复制。NS5蛋白的甲基转移酶(methyltransferase, MTase)活性区主要位于氨基端，与病毒基因组5’端I型帽子结构(m7GpppAm-pGp)的形成密切相关。在帽子结构形成过程中(即GpppA-RNA — m7GpppA_RNA — m7GpppAm-RNA),MTase参与了两步甲基化反应，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine,SAM)为甲基供体，将腺苷酸核糖的2’ -O和N-7甲基化，形成产物S-腺苷-I-高胱氨酸(S-adenosyl-l-homocysteine, SAH)。NS5的MTase活性对于病毒的复制与感染至关重要，当N-7甲基化活性缺陷时、病毒感染复制能力完全丧失，而当2’ -O甲基化活性缺陷后、病毒仍具有复制能力、但其致病性显著减低。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组乙型脑炎病毒及其应用。本发明提供了一种蛋白质，是将序列表的序列3所示蛋白质自N末端第218位氨基酸残基由极性氨基酸突变为非极性氨基酸后得到的蛋白质。该突变使所述蛋白质2’ -O位的甲基化活性丧失，影响乙型脑炎病毒转录加帽过程。
编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为如下I) -3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列2自5’末端第7677-10391位核苷酸所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)所述的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子；3)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜一次。所述极性氨基酸具体可为谷氨酸(E)。所述非极性氨基酸具体可为丙氨酸(A)。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组病毒或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体可为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为在表达载体的pANCR-Ll载体的多克隆位点(如Asc I和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒pAJE70-E218A。所述pANCR-Ll载体为序列表的序列4所示的质粒。所述重组病毒具体可为基因组DNA如序列表的序列2所示的重组乙型脑炎病毒。所述重组病毒具体可为将以上任一所述的重组表达载体导入离体哺乳动物细胞并培养哺乳动物细胞得到的重组病毒。所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞、Vero细胞或C6/36细胞。所述重组病毒具体可为将乙型脑炎病毒中编码NS5蛋白第218位氨基酸残基的核苷酸由极性氨基酸的编码序列突变为非极性氨基酸的编码序列得到的重组病毒。所述NS5蛋白如序列表的序列3所示。所述极性氨基酸具体可为谷氨酸(E)。所述非极性氨基酸具体可为丙氨酸(A)。所述谷氨酸的编码序列具体可为“gag”，所述丙氨酸的编码序列具体可为 “gcc，，。本发明还保护以上任一所述重组病毒在制备乙型脑炎疫苗中的应用。所述疫苗具体可为预防乙型脑炎病毒感染的疫苗。本发明还保护一种乙型脑炎疫苗，它的活性成分为以上任一所述重组病毒。所述疫苗具体可为预防乙型脑炎病毒感染的疫苗。本发明还保护一种降低乙型脑炎病毒的甲基转移酶活性的方法，是将乙型脑炎病毒中编码NS5蛋白第218位氨基酸残基的核苷酸由极性氨基酸的编码序列突变为非极性氨基酸的编码序列。所述NS5蛋白如序列表的序列3所示。所述极性氨基酸具体可为谷氨酸(E)0所述非极性氨基酸具体可为丙氨酸(A)。所述谷氨酸的编码序列具体可为“gag”，所述丙氨酸的编码序列具体可为“gcc”。本发明提供的重组乙型脑炎病毒(乙型脑炎病毒E218A)为甲基转移酶缺陷型，具有如下优点(I)充分减毒，安全性很高；(2)减毒特征稳定，遗传稳定性好，回复为野生型病毒的可能性极低；(3)只在细胞质中复制(即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；
(4)能诱导产生针对野生型乙型脑炎病毒的免疫应答；(5)能够在动物模型中保护动物免受致死剂量的外源乙型脑炎病毒的攻击。综上所述，本发明所提供的重组乙型脑炎病毒可作为乙型脑炎疫苗，对于预防乙型脑炎病毒感染具有良好的应用前景。
图I为野生型乙型脑炎病毒全长RNA的cDNA的结构示意图以及突变位点示意图。图2为实施例I的步骤三的结果。图3为实施例2中间接免疫荧光的结果。图4为实施例3中空斑试验的结果。图5为实施例4中乙型脑炎病毒的在不同细胞内的增殖特征的结果。图6为实施例5中各代病毒液空斑试验的结果。 图7为实施例7中乙型脑炎病毒的神经侵袭力特征的结果(存活率)。图8为实施例7中乙型脑炎病毒的神经侵袭力特征的结果(病毒滴度)。图9为实施例8中乙型脑炎病毒E218A对干扰素的敏感性测定步骤I的结果。图10为实施例8中乙型脑炎病毒E218A对干扰素的敏感性测定步骤2的结果。图11为实施例9中乙型脑炎病毒E218A的免疫原性的结果。图12为实施例10中乙型脑炎E218A重组病毒的免疫保护性的结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pET_28a(+)，购自 Novagen 公司，目录号 CB4746393。大肠杆菌 BL21 (DE3):购自Novagen公司，目录号CB1493450。BHK-21细胞购自ATCC，产品目录号为CCL-10。Vero细胞购自ATCC，产品目录号为CCL-81。C6/36细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-1660。乙型脑炎病毒SA14-14-2株购自成都生物制品研究所；参考文献吴永林，赵宇，黄玉仙等.乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在小鼠体内的动态分布。中国生物制品学杂志，2007，20 (3)204-205)。乙型脑炎强毒株SA14 :参考文献凌静萍，朱荫耕，杜桂枝等，流行性乙型脑炎强毒株和弱毒疫苗株SA14-14-2对猴子和小鼠的致病性和病理学研究，微生物学免疫学进展，2000，4)。实施例I、乙型脑炎病毒E218A的构建与鉴定本实施例的目的为构建一种甲基转移酶缺陷型的重组乙型脑炎病毒(又称乙型脑炎病毒E218A，用E218A表示)。野生型乙型脑炎病毒(强毒株，用WT表示)的全长RNA对应的cDNA的结构示意图以及突变位点的示意图见图I。与野生型乙型脑炎病毒(强毒株)的全长RNA对应的cDNA序列如序列表的序列I所示，自5'末端第I位-95位核苷酸为5' UTR，第96-476位核苷酸为衣壳蛋白C的编码基因(C)，第477-2477位核苷酸为prM_E蛋白的编码基因(prM_E)，第2478位-3722位核苷酸为非结构蛋白NSl的编码基因(NSl)第3723-4607位核苷酸为非结构蛋白NS2的编码基因(NS2)，第4608-6464位核苷酸为非结构蛋白NS3的编码基因(NS3)，第6465-7676位核苷酸为非结构蛋白NS4的编码基因(NS4)，第7677-10391位核苷酸为非结构蛋白NS5的编码基因(NS5)，第10395-10976位核苷酸为3^ UTR0一、载体PAJE70的构建
将序列表的序列I所示的双链DNA分子插入pANCR-Ll载体(pANCR-Ll载体为序列表的序列4所不的质粒；序列4中，自5’末端第2350-2575位核苷酸为sp6启动子)的Asc I和XhoI酶切位点之间，得到载体pAJE70。二、重组质粒pAJE70-E218A的构建I、以载体pAJE70为模板，采用J-BamHI - F和J-E218A-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(2777bp)。
J-BamHI -F :5，-ggaaccacggatccttttcctgactcaaat_3’ ；J-E218A-R :5，_ctaacccaatacatggcgtgattggagtttc_3，。2、以载体pAJE70为模板，采用J-E218A-F和J-XbaI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(840bp)。J-E218A -F :5’ -gaaactccaatcacgccatgtattgggttag-3’ ；J-XbaI-R :5， -accccaaagcttcaaactctagataccgtg-3 ^。3、同时将步骤I的PCR扩增产物和步骤2的PCR扩增产物作为模板，采用J-BamHI - F和J-XbaI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(3586bp)。4、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤3得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。5、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切载体pAJE70，回收载体骨架(约9982bp)。6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pAJE70-E218A。根据测序结果，对重组质粒PAJE70-E218A进行结构描述如下在pANCR-Ll载体的AscI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。序列表的序列2与序列表的序列I的差异仅在于将序列I所示核苷酸自5’末端第8329-8330位核苷酸由“ag”突变为了 “cc”，从而将非结构蛋白NS5自N末端第218位氨基酸残基由谷氨酸(E)突变为了丙氨酸(A)，该突变简称E218A突变。三、E218A突变对甲基转移酶活性的影响野生型非结构蛋白NS5的甲基转移酶区段(简称野生型甲基转移酶)如序列表的序列3所示。突变型非结构蛋白NS5的甲基转移酶区段(简称突变型甲基转移酶)与野生型甲基转移酶的差异仅在于将序列3自N末端第218位氨基酸残基由谷氨酸(E)突变为了丙氨酸(A)。I、重组质粒甲的制备(I)以载体pAJE70为模板，用MTase-F和MTase-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(编码野生型甲基转移酶片段)。MTase-F :5’ -CCCATATGGAAGGCCTGGGGGCAGGAC-3，；MTase-R 5，-CCCTCGAGATGCTCAGGGTCTTTGTGCC-3，。(2)用限制酶NdeI和XhoI双酶切步骤(I)的PCR扩增产物，回收酶切产物。(3)用限制酶NdeI和XhoI双酶切pET_28a(+)，回收载体骨架(约5289bp)。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒甲(表达具有组氨酸标签的野生型甲基转移酶片段，目标分子量为35kD)。2、重组质粒乙的制备(I)以重组质粒pAJE70-E218A为模板，用MTase-F和MTase-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(编码突变型甲基转移酶片段)。步骤(2)和步骤(3)同步骤I的步骤(2)和步骤(3)。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒乙(表达具有组氨酸标签的突变型甲基转移酶片段，目标分子量为35kD)。3、野生型甲基转移酶片段和突变型甲基转移酶片段的制备(I)将重组质粒甲或重组质粒乙导入大肠杆菌BL2 1 (DE3)，得到重组菌。(2)将重组菌接种至LB液体培养基(含60μ g/ml氨苄青霉素)，37°C、250rpm振荡培养至OD6tltlnm=O. 6，然后在培养体系中加入IPTG (使其浓度为O. 4mM), 16°C、250rpm振荡培养18小时。(3)取完成步骤(2)的培养体系,5000rpm离心15min,收集菌体沉淀。(4)用含2mM β -巯基乙醇的裂解液(25mM HEPES，pH 7. 5，500mM氯化钠，10%甘油)重悬步骤(3)得到的菌体沉淀，然后20000rpm离心60min，收集上清液。(5)将步骤(4)得到的上清液上样于镍亲和柱，先用2个柱体积的洗脱液甲洗脱以去除杂蛋白，然后用2个柱体积的洗脱液乙洗脱并收集过柱后溶液。洗脱液甲含20mmol/LTris-HClUOmM咪唑、O. 5mol/L NaCl和 10g/100mL甘油。洗脱液乙含20mmol/L Tris-HCl,200mmol/L 咪唑、O. 5mol/L NaCl 和 IOg/1OOmL 甘油。(6)取步骤(5)收集的过柱后溶液，透析以除去咪唑，浓缩后储存于_80°C。采用重组质粒甲进行上述步骤得到的浓缩液为野生型甲基转移酶片段的蛋白液。采用重组质粒乙进行上述步骤得到的浓缩液为突变型甲基转移酶片段的蛋白液。野生型甲基转移酶片段的蛋白液和突变型甲基转移酶片段的蛋白液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图2A (其中WT表示野生型甲基转移酶片段的蛋白液，E218A表示突变型甲基转移酶片段的蛋白液)，均显示电泳纯的目的条带，且纯度均大于95%。4、甲基化分析合成m7G*pppA-RNA19(l 和 G*pppA_RNA19(l (* 代表后面的磷用磷 32 标记,RNA19tl 代表与序列表的序列I自5’末端第I至190位核苷酸所示的DNA对应的RNA)。步骤如下将序列I自5’末端第I至190位核苷酸进行体外转录(体外转录试剂盒购自Promega,货号为P1280，按说明书操作)并用帽子结构类似物进行加帽(用于加帽的试剂盒购自NEB，货号为S1405L和S1406S，按说明书操作)，P32标记利用NEB公司的牛痘病毒加帽酶(M2080S)完成，过程中加入O. 004单位的无机焦磷酸酶(NEB, M0296L)来增加P32标记的m7G*pppA-RNA190和G*pppA-RNA190的产量。将产物用葡聚糖凝胶柱进行纯化，然后用酚氯仿抽提纯化，并用乙醇沉淀。分别检测步骤3制备的野生型甲基转移酶片段的蛋白液和突变型甲基转移酶片段的蛋白液的甲基转移酶活性。腺苷酸核糖的N-7甲基化分析体系(20 μ I):含4pmol G*pppA-RNA190, 50 μ M未标记的S-腺苷甲硫氨酸(购自NEB公司)，I μ g甲基转移酶片段，2mM 二硫苏糖醇(DTT)，某一浓度(100mM、200mM、300mM 或 400mM)的氯化钠，其余为 50mM Bis-Tris 缓冲液(pH6. O)；30°C孵育 Ih。腺苷酸核糖的2’ -O甲基化分析体系(20 μ I):含2mM 二硫苏糖醇(DTT)，ImM氯化镁，50 μ M未标记的S-腺苷甲硫氨酸，3-4pmol m7G*pppA-RNA190,1 μ g甲基转移酶片段，其余为 50mM Tris-HCl 缓冲液(pH9. O) ;23°C孵育 25min。上述体系中，甲基转移酶片段均以野生型甲基转移酶片段的蛋白液或突变型甲基转移酶片段的蛋白液的形式加入，甲基转移酶片段的质量以蛋白液中的总蛋白质量计。上述反应结束后，用酚-氯仿抽提纯化并用乙醇沉淀RNA，用无RNA酶的水进行重悬后用核酸酶Pl (购自us Biological公司)进行消化，然后溶于O. 65M LiCl溶液并在聚乙烯亚胺纤维素薄层色谱板(JT Baker公司)上进行放射性分析，帽子结构通过放射性同位素P33的标记进行定量。采用野生型甲基转移酶片段时，腺苷酸核糖的N-7甲基化分析结果见图2B，反应初始体系的最适NaCl浓度为300mM。 采用野生型甲基转移酶片段或突变型甲基转移酶片段时，腺苷酸核糖的N-7甲基化分析结果(反应初始体系中的NaCl浓度均为300mM)见图2C。采用野生型甲基转移酶片段或突变型甲基转移酶片段时，腺苷酸核糖的2' -O甲基化分析结果见图2D。结果表明，E218A突变使得腺苷酸核糖的N-7位甲基化水平降低到正常水平的15%，而腺苷酸核糖的2' -O甲基化水平降低到0，即NS5蛋白的第218位氨基酸为谷氨酸对于腺苷酸核糖的2，-O的甲基化是必不可少的，突变为丙氨酸后对2' -O的甲基化活性丧失。四、乙型脑炎病毒E218A的拯救I、用限制性内切酶XhoI酶切重组质粒pAJE70-E218A，回收线性化质粒。2、以步骤I的线性化片段为模板,采用SP6 RiboMAX Express Large Scale RNAProduction Systems (Promega公司产品)并按说明书的步骤进行体外转录，然后采用RNeasy mini kit (Qiagen公司产品)纯化转录体RNA并定量,纯化后的转录体RNA分装后置-80°C冻存待用。3、用脂质体Lipofectamine 2000 (购自Invitrogen公司)将步骤2得到的转录体RNA转染单层BHK-21细胞，方法如下首先将50 μ I OPTI-MEM培养基与4 μ I脂质体混匀，室温放置5min后与10 μ I转录体RNA (5 μ g)和50 μ I OPTI-MEM培养基混合，室温放置20min，然后将混合液加入到6孔板的I个孔中(6孔板中已接种BHK-21细胞)，然后补加450 μ I OPTI-MEM培养基，37°C、5%C02条件下孵育6h，移去上清并补加含2%FBS的DMEM培养基，37°C、5%C02条件下孵育至出现细胞病变，离心收集培养上清，将培养上清重新接种于BHK-21细胞并进行培养，细胞出现病变后离心收集上清，即为乙型脑炎病毒E218A种子液，冻存于_80°C。4、乙型脑炎病毒E218A的RNA检测(I)提取乙型脑炎病毒E218A种子液的总RNA，采用测序引物R13进行反转录，得到 cDNA。测序引物 R13 :5’ -AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA-3’。(2)将步骤(I)得到的cDNA进行测序，测序结果如序列表的序列2所示。五、野生型乙型脑炎病毒(强毒株)的制备用载体pAJE70代替重组质粒pAJE70_E218A进行步骤三，得到野生型乙型脑炎病毒(强毒株)种子液，冻存于_80°C。实施例2、乙型脑炎病毒对BHK-21细胞的感染率分别将实施例I的步骤三的2得到的转录体RNA和步骤四的2得到的转录体RNA进行如下测定
I、用转录体RNA感染单层BHK-21细胞，分别于感染后24、48、72h收取细胞，重悬于含有10%FBS的DMEM培养液后铺于载玻片，37°C、5%C02条件下培养8_12h，即为抗原片，将抗原片置于-20°C丙酮中固定30-60min,晾干后放于_20°C冰箱密封待用。2、采用乙型脑炎病毒包膜E蛋白多抗(购自abeam公司，产品目录号为ab41671),通过间接免疫荧光对BHK-21细胞中的病毒特异蛋白进行检测。方法如下将抗体按适当比例稀释，与抗原片中的BHK-21细胞在37°C孵育l-2h，用PBS缓冲液(IOmM K2HPO4, 2mMKH2PO4,135mM NaCl，2. 7mM KCl，ρΗ7· 4)振荡洗涤3次，每次IOmin,室温晾干；在病毒抗原片上加入用PBS缓冲液800倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，置37°C作用60min，然后将病毒抗原玻片放入PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次lOmin，室温晾干，荧光显微镜下观察结果。
间接免疫荧光的结果见图3。图3中，WT代表野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，E218A代表乙型脑炎病毒E218A。乙型脑炎病毒E218A和野生型乙型脑炎病毒(强毒株)均能够在BHK-21细胞中表达乙型脑炎病毒E蛋白，且蛋白表达量随着时间的延长而增加，乙型脑炎病毒E218A和野生型乙型脑炎病毒(强毒株)对BHK-21细胞的感染率相近。实施例3、乙型脑炎病毒的空斑特征分别将实施例I制备的乙型脑炎病毒E218A种子液和野生型乙型脑炎病毒(强毒株)种子液进行如下检测将滴度为I X 108PFU/mL的乙型脑炎病毒E218A种子液用含2%FBS的DMEM培养基进行10倍梯度稀释(稀释度依次为ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο-6和10_7)。将滴度为4X 108PFU/mL (强毒株)的野生型乙型脑炎病毒(强毒株)种子液用含2%FBS的DMEM培养基进行10倍梯度稀释(稀释度依次为lO'lO'lO'lO'lO'lO—6和10_7)。将各个稀释液分别以500 μ I/孔接种于铺于6孔板的单层ΒΗΚ-21细胞，37°C、5%C02条件下静置l_2h，吸弃培养上清，在每个孔中加入琼脂盖(即含2%FBS和1%琼脂的DMEM培养基)，37°C、5%C02条件下培养3d，然后用4%甲醛室温固定lh，弃琼脂盖，用结晶紫室温染色lOmin，观察空斑形态，并计算空斑形成单位(PFU)。照片见图4。图4中，WT代表野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，E218A代表乙型脑炎病毒E218A。乙型脑炎病毒E218A能形成大小较为均一，边缘清晰的空斑，直径为0.53±0. 16mm (n=20)。野生型乙型脑炎病毒(强毒株)形成的空斑较大，其直径为0.91±0. 18mm (n=20)。上述结果表明，乙型脑炎病毒E218A的空斑直径明显小于乙型脑炎病毒强毒株，因此其具有显著的小斑(small plaque, sp)特征。实施例4、乙型脑炎病毒的在不同细胞内的增殖特征为了观察乙型脑炎病毒在鼠类、灵长类和蚊虫类细胞系中的增殖特征，分别将实施例I制备的乙型脑炎病毒E218A种子液和野生型乙型脑炎病毒(强毒株)种子液进行如下检测将乙型脑炎病毒种子液以MOI=I的接种量接种24孔板中的BHK-21细胞、Vero细胞或C6/36细胞，37°C、5%C02条件下静置lh，吸弃培养上清，补加含2%FBS的DMEM培养液(BHK-21 细胞、Vero 细胞)或含 2%FBS 的 RPMI-1640 维持液(C6/36 细胞)，37°C (BHK-21 细胞、Vero细胞)或28°C (C6/36细胞)、5%C02条件下培养，接种后第24、48和72小时收取培养上清，用空斑滴定法测定病毒滴度(方法同实施例3，均采用BHK-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为PFU/mL，即每毫升上清液中的病毒含量)，绘制一步生长曲线。结果见图5。图5中，WT代表野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，E218A代表乙型脑炎病毒E218A。乙型脑炎病毒E218A在三种细胞系中的复制能力均弱于野生型乙型脑炎病毒(强毒株)。在BHK-21细胞、Vero细胞和C6/36细胞中乙型脑炎病毒E218A分别于感染后第48h、72h和72h达到复制高峰。结果表明，乙型脑炎病毒E218A可在不同细胞系中有效复制，但是复制效率低于野生型乙型脑炎病毒(强毒株)。实施例5、乙型脑炎病毒的遗传稳定性将实施例I制备的乙型脑炎病毒E218A种子液(第零代 病毒液)进行如下检测I、将第零代病毒液以MOI=O. 01的接种量接种于单层VeiO细胞，3d后收集细胞上清(第一代病毒液)，通过空斑试验测定病毒滴度。2、将前一步骤得到的病毒上清以MOI=O. 01接种于单层VeiO细胞，通过空斑试验测定病毒滴度。重复进行9次步骤2，收集每一代的病毒上清，于_80°C冻存待用。3、分别提取每代病毒上清的RNA，采用测序引物R13进行反转录，得到cDNA，以cDNA为模板，采用J-BamHI - F和J-XbaI-R组成的弓丨物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。每代病毒上清的测序结果均一致，均如序列表的序列2自5’末端第5568-9153位核苷酸所示。结果表明，经VeiO细胞传代后，E218A突变均具有基因的遗传稳定性。4、取第零代病毒液、第五代病毒液和第十代病毒液，分别进行蚀斑大小测定(方法同实施例3，采用BHK-21细胞进行空斑测定)。照片见图6。经过在Veix)细胞上若干代传代，乙型脑炎病毒E218A的蚀斑大小无明显变化，且较为均一，表明该重组病毒具有很好的遗传稳定性。实施例6、乙型脑炎病毒的神经毒力特征分别将实施例I制备的乙型脑炎病毒E218A种子液和野生型乙型脑炎病毒(强毒株)种子液进行如下检测将乙型脑炎病毒以8X 103PFU、8X 102PFU、8X IO1PFU或8PFU的剂量颅内接种3周龄BALB/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，每种剂量接种8只小鼠，观察21天内的小鼠发病和死亡情况，接种15天后统计该剂量组小鼠的死亡率(死亡数/接种数)、平均生存时间(到接种第15天还存活的小鼠的生存时间记为15天)和乙型脑炎病毒对小鼠的半数致死剂量(LD5tlX进行三次重复实验，结果取平均值。结果见表I。表I乙型脑炎病毒的神经毒力特征结果
上述结果表明，乙型脑炎病毒E218A的小鼠神经毒力显著弱于其亲本野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，具有明显的减毒特征。实施例7、乙型脑炎病毒的神经侵袭力特征分别将实施例I制备的乙型脑炎病毒E218A种子液和野生型乙型脑炎病毒(强毒株)种子液进行如下检测I、将乙型脑炎病毒以4X IO7PFU的剂量腹腔接种3周龄BALB/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，观察15天内的小鼠发病和死亡情况。进行三次重复实验，每次重复实验每种病毒接种8只小鼠，结果取平均值。结果见图7。图7中，WT代表野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，E218A代表乙型脑炎病毒E218A。该剂量下的野生型乙型脑炎病毒(强毒株)能使小鼠全部死亡，而乙型脑炎病毒E218A对小鼠无致死性。上述结果表明，乙型脑炎病毒E218A的小鼠神经侵袭力显著弱于亲本野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，具有明显的减毒特征。2、将乙型脑炎病毒以4X IO7PFU的剂量腹腔接种3周龄BALB/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，分别在接种1、3、5、7天后以摘眼球方式处死小鼠，每次处死4只，取血和脑组织。血液于4°C静置3h后离心收取血清，56°C灭活30min，用蚀斑法测定血清中病毒滴度(方法同实施例3，采用BHK-21细胞进行空斑测定)。脑组织研磨并均质化后，IOOOOrpm离心IOmin收集上悬液，同样用蚀斑法测定病毒滴度(方法同实施例3,采用BHK-21细胞进行空斑测定)。进行三次重复实验，每次重复实验每种病毒接种16只小鼠，结果取平均值。结果见图8。图8中，WT代表野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，E218A代表乙型脑炎病毒E218A。野生型乙型脑炎病毒(强毒株)感染小鼠24h后，血清中检测到约640PFU/ml的病毒，随后降低到检测阈值之下，而乙型脑炎病毒E218A感染的小鼠血清在I、3、5天均未检测到病毒。野生型乙型脑炎病毒(强毒株)感染组小鼠脑组织中的病毒滴度在1、3、5、7天内均远高于乙型脑炎病毒E218A感染组。乙型脑炎病毒E218A感染组小鼠脑组织的病毒载量在第5天达到峰值(约为8. 4X 103PFU/ml)并在第7天降低到检测阈值之下，野生型乙型脑炎病毒(强毒株)感染组小鼠脑组织中的病毒滴度在第5天的值为I. 4 X 107PFU/ml，并在第7天继续升高至3. 6X 107PFU/ml。以上结果表明，乙型脑炎病毒E218A在小鼠中得神经侵袭力显著弱于野生型乙型脑炎病毒(强毒株)。实施例8、乙型脑炎病毒E218A对干扰素的敏感性测定分别将实施例I制备的乙型脑炎病毒E218A种子液和野生型乙型脑炎病毒(强毒株)种子液进行如下检测(测定病毒对干扰素的敏感性):I、实验组将BHK-21细胞接种于96孔细胞板中，待其长至单层后感染乙型脑炎病毒，感染系数为5，然后将培养板在37°C孵箱孵育lh，吸弃上清并用PBS缓冲液洗三次，然后分别加入不同剂量(10、100或500U/ml)的IFN-a A/D (Sigma)，继续置于37°C孵箱孵48h，收集细胞上清后用蚀斑测定法测定上清液中的病毒滴度(方法同实施例3，采用BHK-21细胞进行空斑测定)，用 MTS(CellAqueous One Solution Cell ProliferationAssay, Promega)的方法测定细胞活力(检测结果通过00492^数值体现)。设置不加入IFN-aA/D只加入乙型脑炎病毒的空白对照组。设置不加入乙型脑炎病毒只加入相应剂量IFN- a A/D的各个阴性对照组。 抑制率=(实验组细胞的( 492 -空白对照组细胞的0D492J/(该实验组的阴性对照组的0D492 -空白对照组的0D492 )。抑制倍数=空白对照组细胞上清的病毒滴度/实验组细胞上清中的病毒滴度。结果见图9。图9中，WT代表野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，Ε218Α代表乙型脑炎病毒Ε218Α。在10、100或500U/ml的IFN- a A/D剂量下，干扰素对乙型脑炎病毒E218A的抑制率(胞内)和抑制倍数(胞外)均显著高于对野生型乙型脑炎病毒(强毒株)的抑制率和抑制倍数，具有统计学差异。这说明乙型脑炎病毒E218A对干扰素更加敏感。2、将BHK-21细胞接种于96孔细胞板，待其长至单层后感染乙型脑炎病毒，感染系数为0. 1、5或10，37°C孵箱孵育lh，吸弃上清，用PBS缓冲液洗三次，然后加入10U/ml的IFN- a A/D (Sigma)处理，继续置于37°C孵箱孵育48h。收集细胞上清后用蚀斑测定法测定上清液中的病毒滴度(方法同实施例3，采用BHK-21细胞进行空斑测定)，用MTS的方法测定细胞活力。结果见图10。图10中，WT代表野生型乙型脑炎病毒(强毒株)，E218A代表乙型脑炎病毒E218A。在不同的感染系数(0. 1、5或10)下，干扰素对乙型脑炎病毒E218A的抑制率(胞内)和抑制倍数(胞外)均显著高于对野生型乙型脑炎病毒(强毒株)的抑制率和抑制倍数，具有统计学差异。这说明乙型脑炎病毒E218A对干扰素更加敏感。实施例9、乙型脑炎病毒E218A的免疫原性将实施例I制备的乙型脑炎病毒E218A种子液进行如下检测实验组(10只):将乙型脑炎病毒E218A腹部皮下接种4周龄BALB/c小鼠，每只小鼠接种剂量为104pfu。阴性对照组(10只):将与实验组的乙型脑炎病毒E218A等体积的PBS缓冲液接种4周龄BALB/c小鼠。分别于免疫后第14d和28d剪尾取血。于4°C静置3h后离心收取血清，56°C灭活30min，-20°C冻存待用。I、免疫小鼠血清中的乙型脑炎病毒特异IgG抗体效价的测定用PBS 缓冲液将免疫血清制备成 1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560和1:5120的稀释液，再通过间接免疫荧光试验测定血清中的IgG抗体效价。间接免疫荧光试验中的抗原为乙型脑炎病毒SA14-14-2株。具体方法如下将上述稀释液分别与抗原片(即吸附有BHK-21细胞的载玻片)中的BHK-21细胞37°C孵育l_2h，PBS缓冲液(IOmMK2HPO4, 2mM KH2PO4,135mM NaCl，2. 7mM KCl, ρΗ7· 4)洗涤 3 次，室温晾干；加入用 0. 02%伊文思兰溶液800倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，置37°C作用60min，PBS缓冲液洗涤3次，室温晾干；荧光显微镜下观察结果，将在显微镜视野下可观察到特异绿色荧光判定为阳性。IgG抗体滴度即可以观察为阳性的最大稀释倍数。实验组小鼠的结果见图11B。免疫14d后，实验组小鼠在的血清中IgG抗体均有显著升高，抗体效价可以达到1:1280，阴性对照组的抗体效价小于1:20。免疫28d后时，实验组小鼠的IgG抗体效价可以达到1:2560。上述结果表明，用IO4PFU乙型脑炎病毒E218A免疫小鼠后，可有效激发小鼠产生高水平且持久的乙型脑炎病毒特异的IgG抗体，乙型脑炎病毒E218A具有良好的免疫原性。
2、免疫小鼠血清中的乙型脑炎病毒中和抗体效价的测定采用空斑减少中和试验测定血清中的中和抗体效价。具体方法如下用PBS缓冲液将血清制备成1:20、1:40、1:80、1:160和1:320倍稀释的稀释液；将稀释液与乙型脑炎强毒株SA14等体积混合(混合液中含约100PFU的乙型脑炎病毒)，37°C孵育I. 5h，然后检测上清中的病毒滴度(方法同实施例3，采用BHK-21细胞进行空斑测定)，依据Reed-Muench法计算50%中和抗体滴度。计算公式如下距离比例=(50-中和空斑数低于50%的百分数)/(中和空斑数高于50%的百分数-中和空斑数低于50%的百分数)。50%中和抗体滴度=(中和空斑数低于50%的稀释度的对数+距离比例χ稀释系数的对数)的反对数。实验组小鼠的结果见图IlA0免疫组能诱发小鼠产生效价大于1:20的中和抗体，其中最高的中和抗体效价可达1:100以上。此外，高水平的中和抗体能维持4周以上。上述数据表明，乙型脑炎病毒E218A还能有效诱发小鼠产生具有保护作用的中和抗体。3、免疫小鼠脾细胞增殖活性及其分泌IFN- Y水平测定免疫后第28d将小鼠断颈处死，于70 %乙醇浸泡片刻后，打开腹腔，取脾。用注射器针芯在200目不锈钢丝网轻轻挤压脾，使单细胞经钢丝网流入平皿内(已装有15ml含10 % FBS RPMI-1640培养基)。单细胞悬液经400目钢丝网过滤后，将滤液于200g离心IOmin0去上清，往沉淀中加入5ml Tris-NH4Cl (pH7. 2)，将细胞悬起，室温放置lOmin，以去除红细胞。200g离心lOmin，去上清，用Tris-NH4Cl (pH7. 2)再去红细胞一次。最后向沉淀中加入5ml含10% FBS RPMI-1640培养基，悬起细胞，计数细胞浓度，置冰浴备用。用PBS缓冲液将脾细胞悬液稀释至2X IO6细胞/ml，加至96孔板(100 μ I/孔)；实验组每孔加入100 μ I热灭活的乙型脑炎病毒SA14-14-2株(2. 5 μ g/ml)，刀豆蛋白A对照组每孔加入ΙΟΟμ I刀豆蛋白Α(2. 5 μ g/ml; Sigma),空白对照组每孔加入100 μ I PBS缓冲液，于37°C培养4天。采用MTS法测定脾细胞在病毒抗原刺激下的增殖情况。MTS法每孔细胞加入30μ lMTS，5h 后，每孔再加入 30μ I 10% SDS (含 O. OlM HCl)，37°C过夜孵育，于 492nm 处测定各孔的吸光值。刺激指数(SI) = OD^ms/ ODsotmso结果见图11C。采用IFN-Y ELISA试剂盒(购自Excell)检测培养上清中的IFN-Y因子含量。结果见图11D。结果显示，在用病毒抗原刺激后，免疫组小鼠的脾细胞增殖活性显著增加，与对照组具有统计学差异。并且脾细胞分泌的IFN-Y因子水平也有显著的提高，这表明用该重组病毒免疫小鼠可以产生较强的细胞免疫水平。实施例10、乙型脑炎E218A重组病毒的免疫保护性将实施例I制备的乙型脑炎病毒E218A种子液进行如下检测实验组(10只)将乙型脑炎病毒E218A腹部皮下接种20只4周龄BALB/c小鼠，每只小鼠接种剂量为IO4PFU,4周后皮下接种10LD50的乙型脑炎强毒株SA14。
对照组用等体积的PBS缓冲液代替乙型脑炎病毒，其他同实验组。攻毒后每日观察小鼠的存活状况，共15天。结果显示见图12，对照组的小鼠在第9天全部死亡，而实验组的小鼠在15天全部存活，保护率为100%。这表明，以致死剂量腹腔攻击小鼠的情况下，该重组病毒可为小鼠提供完全保护，进一步表明该重组病毒具有良好的免疫保护性。
权利要求
1.一种蛋白质，是将序列表的序列3所不蛋白质自N末端第218位氣基酸残基由极性氨基酸突变为非极性氨基酸后得到的蛋白质。
2.编码权利要求I所示蛋白质的基因。
3.如权利要求I所述的基因，其特征在于所述基因为如下I)-3)中任一所述的DNA分子 1)序列表的序列2自5’末端第7677-10391位核苷酸所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)所述的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子； 3)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组病毒或重组菌。
5.如权利要求4所示的重组病毒，其特征在于所示重组病毒为基因组DNA如序列表的序列2所示的重组乙型脑炎病毒。
6.权利要求4或5所述重组病毒在制备乙型脑炎疫苗中的应用。
7.—种乙型脑炎疫苗，它的活性成分为权利要求4或5所述的重组病毒。
8.一种降低乙型脑炎病毒的甲基转移酶活性的方法，是将乙型脑炎病毒中编码NS5蛋白第218位氨基酸残基的核苷酸由极性氨基酸的编码序列突变为非极性氨基酸的编码序列。
全文摘要
本发明公开了一种重组乙型脑炎病毒及其应用。本发明提供了一种蛋白质，是将序列表的序列3所示蛋白质自N末端第218位氨基酸残基由极性氨基酸突变为非极性氨基酸后得到的蛋白质。本发明还保护编码所述蛋白质的基因、含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组病毒或重组菌。本发明还保护一种乙型脑炎疫苗，它的活性成分为所述重组病毒。本发明所提供的重组乙型脑炎病毒可作为乙型脑炎疫苗，对于预防乙型脑炎病毒感染具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/93GK102964434SQ20121047915
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者秦成峰, 史佩勇, 李世华, 李晓峰, 赵慧, 秦鄂德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所