专利名称：一株重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶c的方法
技术领域：
本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一株重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法。
背景技术：
磷脂酶C (PLC)，又可称为可定向分解磷脂生成甘油二酯和磷酸单酯，细菌来源的磷脂酶C根据底物特异性的不同主要分为磷脂酰特异性磷脂酶C (PC-PLC)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (PI-PLC)0 PLC水解产物甘油二酯是一种生理活性物质，在细胞信号传导途径上起着第二信使的作用，能激活蛋白激酶C (PKC)而引起细胞增殖、分化、收缩、分泌和代谢等功能变化，此外还具有明显的抗血小板粘附、聚集等功能，因此又被称作溶血性磷脂 酶C。溶血性PLC对新型抗血小板药物、心脑血管疾病类药物的开发具有一定的潜在价值，对抗静脉血栓及高血压医疗方面的研究意义重大。随着对PLC研究的不断深入及工业发展的需求，PLC的应用价值已经逐渐从药品生产扩展至油脂精炼、磷脂改性、食品加工等领域。例如在油脂精炼中，利用PLA和PLC混合物进行酶法脱胶，可完全除去磷脂，比水、酸或苛性碱脱胶具有更高的油产率；食品工业中PLC可用来改善在面包在烤制时其表面产生的老化现象，缓和梨皮状表皮。近年来，随着PLC在食品、医药、饲料等领域的广泛应用，国内外学者对其进行了大量的研究。国外对PLC的研究一直处于领先水平，例如1982年Vasil等人构建了一株 P. aeruginosaPA02003 (pVB81) -CT，其所产溶血性 PLC 的酶活达到了 442. 8U/ml(Vasil ML, Berka MR, Gray GL, Nakai H. Cloning of aphosphate-regulated hemolysingene (phospholipase C)from Pseudomonasaeruginosa. Journal of Bacteriology,1982,152 :431-440. ) ；1990年Ostroff等人将构建的重组质粒pGEM2/PLC_H导入到E. coliBL21 (DE3)中，成功得到了一株产溶血性PLC的菌株，该菌株的PLC活性可达到166. 7U/ml (Ostroff RM, VasilAI, Vasil ML. Molecular comparison of a nonhemolytic and ahemolyticphospholipase C from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology,1990,172(10) :5915-5923.) ; 1997 年 Cota-Gomez 等人成功构建了 E. coli BL21 (DE3)pGEM-plcHR，该菌株可产溶血性PLC，其酶活达到24. IU/毫克(Cota-Gomez A, Vasil Al,Kadurugamuwa J,Beveridge TJ,Schweizer HP, Vasil ML. PlcRl and PlcR2are putativecalcium-binding proteins required for secretion of the hemolyticphospholipaseC of Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity, 1997,65 :2904-2913. X 国内对磷脂酶C的研究虽起步较晚，但也取得了一定成果，例如2005年陈涛等人对筛选到的产PLC菌株Bacillus cereus Shenzhen754_l进行三次紫外线和两次Co60_ Y射线诱变处理，筛选出三株高PLC活性的诱变株，酶活分别达到14. 878、16. 450、16. 400U/ml (陈涛，王常高，刘晓辉，何东平.高产磷脂酶C菌株的诱变选育.天然产物研究与开发，2005，17 (6)712-716. ) ;2007年高林对Bacillus cereus Shenzhen 754-1进行培养条件的优化，将酶活提高至26U/mL (高林.磷脂酶C高产菌株的筛选、鉴定和培养条件的优化研究.安徽农业大学的硕士学位论文，2007. );2010年詹逸舒筛选到一株Bacillus cereus Z-13，用卵黄琼脂杯碟法测定该菌株所产生的PLC的沉淀圈(乳白色沉淀圈)，其直径可达30_，酶活达到23.31U/ml (詹逸舒.产磷脂酶C菌株的筛选及其酶学性质的研究.湖南农业大学的硕士学位论文，2010.)。与动植物来源的PLC相比，上述微生物来源的PLC具有更短的生产周期，但仍存在如下弊端如野生菌株分离纯化耗资大，大多数具有潜在病原性，在食品安全性方面存在一定隐患；基因工程菌株其构建和产酶工艺较为复杂，产酶量还有待提高。因此，目前高纯度的PLC商业化生产尚未实现。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一株重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法。利用该菌株通过液体发酵来生产溶血性磷脂酶C，产酶量和酶活性高，安全性好，制酶工艺简单，成本低。 本发明的技术方案如下一株重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET_plcH，保藏编号为 CCTCCNo. M 2012425。所述重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-p IcH, CCTCC No. M 2012425由下述方法制得(I)以保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的基因组为模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其碱基序列如SEQ ID N0:1所示；(2)将步骤(I)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表达载体pET-28a ( + )上，得到重组载体；(3)将步骤(2)所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌。本发明还提供了一种用上述重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH, CCTCCNo. M2012425制备溶血性磷脂酶C的方法，是以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备溶血性磷脂酶C。其具体步骤如下(I)种子培养将所述重组大肠杆菌 BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCC No.M2012425接种于种子培养基中，于30 37°C振荡培养8 12h，摇床转速150 200r/min ；(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比3 10%的接种量接种至发酵培养基，于30 37°C振荡培养4 6h小时，摇床转速150 200r/min ；再添加乳糖，于20 30°C振荡诱导培养14 22h，摇床转速150 200r/min ;最后添加甘氨酸，于相同条件下继续振荡诱导培养18 36h，发酵完毕，得到发酵液；(3)粗酶液的提取将步骤(2)所得发酵液离心；收集上清液，即为胞外粗酶液；收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。其进一步的技术方案为步骤(I)所述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨9 Ilg,酵母粉4 6g,NaCl9 llg，其余成分为水。步骤(2)所述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨9 llg，酵母粉5 24g，甘油 0 5g，其余成分为 0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2)。
步骤(2)所述乳糖的添加量为每升所述发酵培养基0. I 5g。步骤(2)所述甘氨酸的添加量为每升所述发酵培养基0 3g。本发明所提供的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，已于2012年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC NO :M2012425，地址中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称重组大肠杆菌BL21 (DE3) /pET-plcH CCTCC M 2012425。本发明有益的技术效果在于与现有产溶血性磷脂酶C的野生分离菌株以及基因工程菌株相比，本发明构建了一株目的基因来源于铜绿假单胞菌(P. aeruginosa),可高产溶血性磷脂酶C的基因工程重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH CCTCC M 2012425，利用该菌株通过液体发酵来生产溶血性磷脂酶C，产酶量高，其酶活性最高可达2130. 38U/ml，比原菌株(铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，保藏编号CGMCCNo. I. 205)提高了约4. 3倍，且安全性好；该制酶方法生产工艺简单、成本低、易于工艺放大，在油脂精炼、磷脂改性、医疗等领域具有一定的应用前
旦
o溶血性磷脂酶C酶活和溶血能力的测定方法如下(I)硼砂卵黄平板法以及哥伦比亚血琼脂平板法定性测定酶活。将发酵液进行超声破碎，取100 200 U L破碎后的上清液加入等距放置在硼砂卵黄或哥伦比亚血琼脂平板上的牛津杯中，于37° C温育12 24h，以生成的分解圈(透明圈或浑浊圈)和溶血圈的大小分别代表酶活和溶血能力的高低。(2)p-NPPC法定量测定酶活。P-NPPC是卵磷脂的一种底物结构类似物，PLC可水解p-NPPC生成对硝基苯酹,对硝基苯酹是一种黄色物质,在410nm处有最大吸收峰,利用分光光度法测定发酵液在410nm处的吸光值，可反映PLC水解p-NPPC产生对硝基苯酚的量，根据对硝基苯酚标准曲线可定量计算出相应酶活力大小；以IL反应液体系计，其组成如下lmmol ZnCl2、600g 山梨醇、IOmmol p-NPPC、其余成分为 0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2), ImL反应体系中加入100 u L的发酵液，于37° C反应30min ;酶活力单位定义如下在pH 7. 2，温度为37° C的条件下，每分钟水解p-NPPC产生Inmol对硝基苯酚所需的酶的量为I个酶活力单位(U)。上述测定方法中，所述硼砂卵黄培养基成分如下NaCl 6. 6g/L，硼酸10. 9g/L，硼砂I. 9g/，琼脂15g/L，卵黄液20g/L，其余成分为水，pH7. 2 7. 4，于I X IO5Pa高压灭菌20mino上述测定方法中，所述哥伦比亚血琼脂培养基的制备方法如下将4. 4g哥伦比亚血琼脂基础(购自北京陆桥技术有限责任公司)加入到IOOml去离子水中，于IXlO5Pa高压灭菌20min,冷却至50° C,加入5 7mL无菌脱纤维绵羊血(购自广州蕊特生物科技有限公司)，摇匀后倾注平板，即得。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式
做进一步的描述，以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用实验材料如下大肠杆菌感受态细胞E. coli JM109和E. coli BL21 (DE3)购自宝生物工程(大连)有限公司；铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为=CGMCC No. I. 205 ；pMD 18T-simple Vector、T4DNA连接酶和10 X T4连接酶Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司；pET-28a ( + )购自Novagen ;限制性内切酶Bam HI、Sac I以及共有Buffer购自Fermentas0实施例I溶血性磷脂酶C基因的克隆根据NCBI上提供的P. aeruginosaPAOl的plcH基因(NC 002516. 2)的序列设计引物，其中，上游 引物为5’ -CGGGATCCATGACCGAAAACTGGAAATTC~3/ (下划线表示Bam HI酶切位点)，下游引物为5' -CGAGCTCTCAGGTCGCTGCGATGTC-3'(下划线表示Sac I酶切位点)。以保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的基因组DNA为模板，运用PCR的方法克隆得到溶血性磷脂酶C基因，并与载体pMD18T-Simple连接构建克隆载体pMD-plcH，将该克隆载体转化大肠杆菌感受态细胞E. coli JM109，挑选阳性克隆，测序验证，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示，结果表明溶血性磷脂酶C基因克隆成功。实施例2重组质粒pET-plcH的构建用Bam HI和Sac I对重组载体pMD-plcH和表达载体pET_28a ( + )进行双酶切，酶切反应体系为 IOu L pET-28a ( + ) 8u L, Bam HI 和 Sac I 各 0. 5 y L、Bam HI 和 Sac I共用Buffer IuL0回收目的基因和载体DNA，并用T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系IOyL:目的基因 5iiL、载体 DNA 3 ii L、10X T4 连接酶 Buffer I y L、T4DNA 连接酶 I y L，于16°C 反应 12h。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E. coli JM109，转化方法如下(I)取 E. coli JM109 100 ii L 置于无菌 I. 5ml EP 管中；(2)加入上述连接产物并轻轻混匀；(3)将上述EP管置于42°C金属浴，精确计时90s，勿摇动EP管；(4)转移EP管于冰浴中，冷却2min ；(5)每管加入无菌LB培养基800ii L，置于37°C培养箱复苏Ih ；(6)以8000r/min的转速离心2min，吸去800 u L上清培养基，用移液枪轻轻吹吸剩余培养基和细胞，并转移至含终浓度100 u g/ml卡那霉素的LB固体平板，涂匀并于37°C培养箱培养16 24h ；(7)挑取阳性克隆，并经Bam HI和Sac I双酶切验证。实施例3 重组大肠杆菌 BL21 (DE3) /PET-pIcHCCTCC M 2012425 的构建将构建好的重组质粒pET-plcH转化大肠杆菌BL21 (DE3)，转化方法如下(I)取 E. coli BL21 (DE3) 100 ii L 置于无菌 I. 5ml 的 EP 管中；(2)加入上述重组质粒pET-plcH并轻轻混匀；(3)将上述EP管置于42°C金属浴，精确计时90s，勿摇动EP管；(4)转移EP管于冰浴中，冷却2min ；(5)每管加入无菌LB培养基800 iiL，置于37°C培养箱复苏Ih ；(6)以8000r/min的转速离心2min，吸去800 u L上清培养基，用移液枪轻轻吹吸剩余培养基和细胞，并转移至终浓度100 u g/ml卡那霉素的LB固体平板，涂匀并于37°C培养箱培养16 24小时；(7)挑取转化子，酶切验证重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET_plcH构建成功，与等体积的体积分数为30%的甘油混匀，于-70°C保藏。用重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH CCTCC M 2012425制备溶血性磷脂酶C实施例4(I)种子培养取50 ii L上述保藏的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于37°C振荡培养10h，摇床转速150r/min ;上述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨IOg,酵母粉5g,NaCl IOg,其余成分为水，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比5%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于 37°C振荡培养4h小时，摇床转速200r/min ;添加乳糖至终浓度为0. lg/L，在回旋式摇床上于25°C振荡诱导培养14h，摇床转速为150r/min ;发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨10g，酵母粉5g，其余成分为0. 25mol/L Tris-HCl (pH7.2)，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(3)粗酶液的提取将步骤(2)所得发酵液于4°C离心lOmin，转速8000r/min ;收集菌体细胞沉淀，用25mmol/L Tris-HCl (pH7. 2)重悬菌体，置于超声破碎仪中超声破碎lOmin，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。利用p-NPPC法定量测得胞内粗酶液的酶活达到573. 201U/ml,比保藏编号为CGMCC No. I. 205 的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)提高了约 15% 实施例5(I)种子培养取50 ii L上述保藏的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于30°C振荡培养8h，摇床转速200r/min ;上述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨9g,酵母粉4g, NaCl 9g,其余成分为水,于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比10%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于30°C振荡培养6h小时，摇床转速150r/min ;添加乳糖至终浓度为lg/L，在回旋式摇床上于20°C振荡诱导培养22h，摇床转速为220r/min ;发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨9g，酵母粉24g，其余成分为0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2)，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。( 3 )粗酶液的提取同实施例4利用p-NPPC法定量测得胞内粗酶液的酶活达到722. 89U/ml,比保藏编号为CGMCCNo. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)提高了约40*%。实施例6(I)种子培养取50 ii L上述保藏的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于35°C振荡培养12h，摇床转速180r/min ;上述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨llg，酵母粉6g,NaCl llg，其余成分为水，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比5%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于35°C振荡培养5h小时，摇床转速180r/min ;添加乳糖至终浓度为0. lg/L，在回旋式摇床上于30°C振荡诱导培养18h，摇床转速为180r/min ;再添加甘氨酸至终浓度为lg/L，于相同条件下继续振荡诱导培养18h ;发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨Hg，酵母粉14g，甘油lg，其余成分为0. 25mol/L Tris_HCl(pH7. 2)，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(3)粗酶液的提取将步骤(2)所得发酵液于4°C离心lOmin，转速8000r/min，收集上清液，即为胞外粗酶液；收集菌体细胞沉淀，用25mmol/L Tris-HCl (pH7. 2)重悬菌体，置于超声破碎仪中超声破碎lOmin，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液；利用p-NPPC法定量测得胞内和胞外粗酶液的总酶活达到959. 14U/ml,比保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)提高了约I. 9倍。实施例7(I)种子培养取50 ii L上述保藏的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于32°C振荡培养9h，摇床转速150r/min ;上述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨IOg,酵母粉4g, NaCl 9g,其余成分为水，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比10%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于32°C振荡培养4h小时，摇床转速150r/min ;添加乳糖至终浓度为0. lg/L，在回旋式摇床上于22°C振荡诱导培养16h，摇床转速为150r/min ；，再添加甘氨酸至终浓度为2. 5g/L，于相同条件下继续振荡诱导培养28h ;发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨llg，酵母粉14g，甘油2g，其余成分为0. 25mol/L Tris-HCl(pH7. 2)，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(3)粗酶液的提取同实施例6利用p-NPPC法定量测得胞内和胞外粗酶液的总酶活达到1130. 28U/ml,比保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)提高了约2. 2倍。实施例8(I)种子培养取50 ii L上述保藏的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于30°C振荡培养llh，摇床转速180r/min ;上述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨9g,酵母粉5g, NaCl IOg,其余成分为水，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比10%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于30°C振荡培养6h小时，摇床转速180r/min ;添加乳糖至终浓度为5g/L，在回旋式摇床上于28°C振荡诱导培养20h，摇床转速为180r/min ;发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨9g，酵母粉17g，甘油3g，其余成分为0. 25mol/L Tris-HCl(pH7. 2),于 IX IO5Pa 高压下灭菌 20min。(3)粗酶液的提取同实施例4利用p-NPPC法定量测得胞内粗酶液的酶活达到1422. 37U/ml,比保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)提高了约2. 8倍。
实施例9(I)种子培养取50 ii L上述保藏的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于35°C振荡培养8h，摇床转速200r/min ;上述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨llg，酵母粉6g,NaCl llg，其余成分为水，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比10%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于35°C振荡培养5h小时，摇床转速200r/min ;添加乳糖至终浓度为2. 5g/L，在回旋式摇床上于20°C振荡诱导培养14h，摇床转速为200r/min ;发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨llg，酵母粉20g，甘油4g，其余成分为0. 25mol/L Tris-HCl(pH7. 2),于 IX IO5Pa 高压下灭菌 20min。
( 3 )粗酶液的提取同实施例4利用p-NPPC法定量测得胞内粗酶液的酶活达到1208. 42U/ml，比保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)提高了约2. 4倍。实施例10(I)种子培养取50 ii L上述保藏的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于32°C振荡培养10h，摇床转速150r/min ;上述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨9g,酵母粉4g,NaCl 9g,其余成分为水,于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比10%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于34°C振荡培养4h小时，摇床转速150r/min ;添加乳糖至终浓度为5g/L，在回旋式摇床上于25°C振荡诱导培养18h，摇床转速为150r/min ;再添加甘氨酸至终浓度为3g/L，于相同条件下继续振荡诱导培养28h ;发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨9g，酵母粉5g，甘油5g，其余成分为0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2)，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。( 3 )粗酶液的提取同实施例6利用p-NPPC法定量测得胞内和胞外粗酶液的总酶活达到2130. 38U/ml,比保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)提高了约4. 3倍。实施例11(I)种子培养取50 ii L上述保藏的重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接种于种子培养基中，在回旋式摇床上于37°C振荡培养12h，摇床转速200r/min ;上述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨llg，酵母粉6g,NaCl llg，其余成分为水，于I X IO5Pa高压下灭菌20min。(2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比10%的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基装于250ml三角瓶，装液量为50ml，在回旋式摇床上于37°C振荡培养6h小时，摇床转速200r/min ;添加乳糖至终浓度为5g/L，在回旋式摇床上于30°C振荡诱导培养22h，摇床转速为200r/min ;再添加甘氨酸至终浓度为2g/L，于相同条件下继续振荡诱导培养36h ;发酵完毕，得到发酵液；上述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨 llg，酵母粉 20g，甘油 5g，其余成分为 0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2)，于 I X IO5Pa 高压下灭菌20min。( 3 )粗酶液的提取同实施例6利用p-NPPC法定量测得胞内和胞外粗酶液的总酶活达到1756. 61U/ml,比保藏编号为CGMCC No. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)提高了约3. 5。综上所述，实施例10所述制酶方法具·有最高的产酶量，为最佳实施例。
权利要求
1.一株重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-plcH，保藏编号为 CCTCCNo. M 2012425。
2.根据权利要求I所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-pIcH, CCTCC No. M2012425，其特征在于由下述方法制得 (1)以保藏编号为CGMCCNo. I. 205的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的基因组为模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其碱基序列如SEQ ID NO :I所示； (2)将步骤(I)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表达载体pET-28a( + )上，得到重组载体； (3)将步骤(2)所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌。
3.用权利要求I 2任一项所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M2012425制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于以该重组大肠杆菌为发酵菌株进行液体发酵，制备溶血性磷脂酶C。
4.根据权利要求3所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于具体步骤如下 (1)种子培养将所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCC No. M2012425接种于种子培养基中，于30 37°C振荡培养8 12h，摇床转速150 200r/min ； (2)液体发酵培养将经过步骤(I)培养所得活化种子液按体积百分比3 10%的接种量接种至发酵培养基，于30 37°C振荡培养4 6h小时，摇床转速150 200r/min ;再添加乳糖，于20 30°C振荡诱导培养14 22h，摇床转速150 200r/min ;最后添加甘氨酸，于相同条件下继续振荡诱导培养18 36h，发酵完毕，得到发酵液； (3)粗酶液的提取将步骤(2)所得发酵液离心；收集上清液，即为胞外粗酶液；收集菌体细胞沉淀并超声破碎，将所得超声破碎液离心，取上清，即为胞内粗酶液。
5.根据权利要求4所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步骤(I)所述种子培养基成分按克/升计为蛋白胨9 Ilg,酵母粉4 6g, NaCl 9 llg，其余成分为水。
6.根据权利要求4所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步骤(2)所述发酵培养基成分按克/升计为蛋白胨9 Ilg,酵母粉5 24g,甘油O 5g,其余成分为O. 25mol/L Tris-HCl (ρΗ7· 2)。
7.根据权利要求4所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步骤(2)所述乳糖的添加量为每升所述发酵培养基O. I 5g。
8.根据权利要求4所述制备溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步骤(2)所述甘氨酸的添加量为每升所述发酵培养基O 3g。
全文摘要
本发明提供一种重组大肠杆菌及用其制备溶血性磷脂酶C的方法。用目的基因来源于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCC No.M 2012425作为发酵菌株进行液体发酵来制备溶血性磷脂酶C，其制备方法包括种子培养、液体发酵培养以及粗酶液的提取。利用本发明菌株通过液体发酵来生产溶血性磷脂酶C，产酶量和酶活性高，安全性好，制酶工艺简单，成本低，易于工艺放大，在油脂精炼、磷脂改性、医疗等领域具有一定的应用前景。
文档编号C12N15/55GK102978146SQ20121048063
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者张梁, 石贵阳, 赵金星, 丁重阳, 顾正华 申请人:江南大学