专利名称：增强外源蛋白表达的增强子样基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种增强外源蛋白表达的增强子样基因序列，用于提高外源基因在原核细胞中的蛋白表达水平。
背景技术：
随着分子生物学及基因工程的发展，外源基因表达为蛋白表达系统的开发提供了广阔的应用前景。目前常用的蛋白表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统是目前研究较为成熟的，但是某些表达的目的产物仍表达水平很低；酵母表达系统也经常出现外源基因拷贝数低；哺乳动物细胞表达系统，外源基因不能持久表达，且成本很高，技术背景复杂。因此，无论在何种表达系统中，外源基因表达水平低都是一个共有的难题。20世纪80年代初，首先在真核病毒SV40基因组中发现了能够增强蛋白表达基因序列(Banerji J et aL, CeLL, 1981，27(2Ptl) : 299-308)，此后研究证明这类序列广泛存在于真核生物及其病毒基因组中，这对改造蛋白表达系统提供了一个新的方向。对原核生物基因表达调控的深入研究，人们发现在原核生物基因组也存在类似于真核转录增强调控模式，且某些真核生物DNA片段在原核细胞中也具有增强子样功能，这类序列称为增强子样序列(enhancer-Like sequence,ERLS)。目前开发改进的蛋白表达系统中，通过增加蛋白表达标签，补充外源基因表达所需的稀有密码子以及增加表达系统中外源基因拷贝数等方法使用较多，采用增强子样基因序列改进蛋白表达系统目前使用比较少，且很多未知的调控基因表达序列可能尚未被开发。增强子(enhancer，ER)，在基因表达调控中，增强子长度通常为10(T200bp，与启动子、绝缘子及沉默子协同作用，对调控基因的时空表达具有重要作用。增强子重要作用特点之一无方向性，即不论增位于启动子上游或下游，均能激活其相应启动子。它的增强活 性能体现在基因的表达水平上，目前已有少数的增强子样序列应用于提高蛋白表达水平。基因陷阱(gene trap)是研究基因与调节元件功能的一个有力工具。目前已成功地应用于果蝇、小鼠、拟南芥等重要模式动植物的功能基因组研究(O’Brochta DA et aL, Proc NatLAcadSci USA, 2011，108(39) : 16339-16344)，并发现了大量的新基因。本发明增强子样基因序列的筛选方法即采用了融合报告基因和基因陷阱的思路，增强子样序列诱捕载体以人乳头瘤病毒(Human PapiLLomavirus, HPV)58型主要衣壳蛋白LI基因和氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)融合表达作为报告基因，在增强子样序列插入时，菌株的氯霉素抗性提高，因而通过增加氯霉素浓度达到大规模筛选以获得相应的增强基因表达的序列。目前发现的增强子样序列(enhancer-Like sequence, ERLS)主要应用在增强低分子量蛋白表达，例如干扰素，白细胞介素，本发明的报告基因需要表达较大融合蛋白基因(85KD),利用该融合基因筛选的序列也可构建一种高分子量蛋白表达系统,进而解决一些高分子量基因在外源表达系统中产率低的难题。大肠杆菌是重要基因工程菌，遗传背景清楚，操作简便、快速且成本低廉，成为筛选表达外源基因原核增强子样序列的首选。因此，本发明将病毒衣壳蛋白与抗生素基因连接形成融合表达报告基因，发现的增强外源基因表达的增强子样基因序列ER1，可作为改善异源基因原核表达系统方面具有重要实用价值一种工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强外源蛋白表达的增强子样基因，旨在改进外源基因原核表达系统，该增强子样基因序列具有如SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列或其截短序列。本发明中所述增强子样基因截短序列为增强子样基因ERl任一长度的序列，如实施例7即为其截短序列，核苷酸序列为SEQ ID NO 1第99 516bp所示。本发明首先抽提细菌基因组样品，细菌基因组源于昆明市呈贡区居民生活污水样品和昆明市第四十三解放军总医院附近污水处理厂污水样品中的细菌经富集抽提获得。基因组经酶切500bp以下DNA片段，并由此构建到增强子样序列筛选重组载体Ll-CAT-pET21a启动子上游，构建基因文库，通过氯霉素抗性融合报告基因筛选含增强子样序列的菌株，之 后，对菌株抗氯霉素抗性和增强子样序列进行了来源分析及其增强外源蛋白表达的能力进行检测。本发明通过如下技术方案实现本发明目的
(O构建含融合报告基因的重组筛选菌株
由云南省第一人民医院(云南省昆华医院)宫颈癌患者的肿瘤组织样品经过样品处理，抽提DNA，通过PCR扩增获得人乳头瘤病毒HPV58型LI基因，并构建成Ll_pMD18_T载体。从Ll-pMD18-T上将LI基因酶切下来，通过胶回收纯化后，连接到含有CAT基因的重组载体CAT-pET21a上，并通过酶切鉴定，测序验证Ll_CAT_pET21a载体构建正确。含融合报告基因载体Ll-CAT-pET21a采用热休克法转化到大肠杆菌表达菌株中，获得重组筛选菌株Ll-CAT-pET21a/BL21(DE3)；
大肠杆菌表达菌株可选自 E. coZiBL21 (DE3)、Ε· coLi BL21 (DE3) pLys、Origami 或Rosetta,以及其它用于外源蛋白表达的原核菌株；
(2)重组菌株抗氯霉素阈值和LI -CAT融合蛋白表达水平检测在一定浓度梯度氯霉素固体Amp+-LB培养基中，重组筛选菌Ll-CAT-pET21a/BL21(DE3)使用IPTG诱导，记录菌落生长数目，测定菌株抗氯霉素阈值。而含有融合报告基因Ll-CAT大肠杆菌转化子进一步液体培养并用IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE检测融合蛋白Ll-CAT的表达。(3)基因文库构建与含增强子样基因序列的菌株筛选
待筛选各污水样品经细菌富集，获得菌体培养物，按《精编分子生物学实验指南》(科学出版社)细菌基因组DNA提取方法制备细菌基因组。基因组利用限制性内切酶Sau3A I酶切至500bp以下DNA片段，冻融法胶回收，并与经沒貧7 II酶切后去磷酸化检测载体Ll-CAT-pET21a连接，即待检序列通过同尾酶互补连接到载体启动子上游，电转化至E. coZiBL21 (DE3)感受态，构建细菌基因组文库。之后，含增强子样基因序列的菌株筛选用高于抗氯霉素阈值初步筛选，获得单克隆菌株。所获菌株的质粒进行酶切鉴定，并利用氯霉素浓度梯度测定其抗氯霉素阈值，含增强子样基因序列的菌株筛选即完成。本发明中表达载体可选自PET系列、PQE系列、pGEX系列、pMAL系列，以及其它原核系统的表达载体。
(4)序列测定，同源性分析序列来源及其诱导蛋白表达增强活性分析
在插入位点下游设计引物ENHP2，将引物和质粒送至测序公司，测定插入序列。所测序列原始载体序列利用DNAMAN (5. 2.2版)比对，确定插入序列，并将这些序列在NCBIBLastN进行序列同源性检索分析序列来源。并且构建了 ERl-Lll-pET21a/BL21(DE3)和Lll-pET21a/BL21 (DE3)重组菌，通过SDS-PAGE再次检测ERl序列是否能够增强HPV LI截短序列Lll蛋白表达。本发明另一目的是将增强外源蛋白表达的增强子样基因应用在增强外源蛋白表达中，该基因插入到表达载体启动子上游和启动子下游的任意位置。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
I、在现有的表达系统中很多外源基因经常出现蛋白表达水平低，进而使这些基因工程产品的进一步开发受限，本发明ERl序列能够提高融合表达报告基因(85KD)抗氯霉素的抗 性，且能够明显增加人乳头瘤主要衣壳蛋白LI基因截短序列Lll的蛋白表达，该序列能够促进较大外源基因在原核表达系统中增加蛋白表达水平特性。2、表达载体选自pET系列,ERl序列可适用于原核表达系统的所有表达载体,提高了该序列应用到各原核表达系统的可能性，这对提高ERl序列实用性具有重要的意义。
图I是载体CAT-pET21a酶切鉴定电泳示意图；其中泳道I DNA Marker DL5000 ；泳道2 1号菌落质粒CAT-pET21a BamH I ,Xho I酶切；泳道3 2号菌落质粒CAT_pET21aBam^ I ,Xho I 酶切。图2是载体Ll-CAT_pET21a酶切鉴定电泳示意图；其中泳道I :DNA MarkerDL5000 ;泳道 2 Ll-CAT-pET21a BamH I 单酶切；泳道 3 :Ll_CAT-pET21a BawR I、Nde I 双酶切；泳道4 :质粒Ll-CAT-pET21a。图3 是重组菌 Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3)诱导表达 L1-CAT 融合蛋白 SDS-PAGE示意图；其中泳道 I Protein Marker ;泳道 2 :Ll_CAT-pET21a/BL21 (DE3)诱导前；泳道 3 Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3)诱导后 4h ;泳道 4 BL21 (DE3)诱导前；泳道 5 BL21 (DE3)诱导后4h。图4是I酶切基因组胶回收电泳示意图；其中泳道I :DNA Marker DL2000 ；泳道2 500bp以下DNA回收片段。图5是载体ERl-Ll-CAT-pET21a酶切鉴定电泳示意图；其中泳道I :DNA MarkerDL15000 ;泳道 2 Ll-CAT-pET21a EcoR V , Nde I 双酶切；泳道 3 :ERl-Ll_CAT-pET21aEcoRN、Nde I 双酶切。图6是载体Lll- pET21a酶切鉴定电泳示意图；其中泳道I :DNA Marker DL5000 ；泳道 2 Lll-pET21a Xho I、Nde I 双酶切；泳道 3 :质粒 Lll_pET21a。图7是载体ERl-Lll- pET21a酶切鉴定电泳示意图；其中泳道I :DNA MarkerDL5000 ;泳道2 1号菌落质粒ERl-Lll-pET2la EcoR I、Nde I双酶切；泳道3 2号菌落质粒 ERl-Lll-pET21a EcoR I、Nde I 双酶切；泳道 4 Lll-pET21a EcoR I、Nde I 双酶切。图8 是重组菌 ERl-Lll-pET21a/BL21(DE3)诱导表达 Lll 蛋白 SDS-PAGE 示意图；其中泳道 I :Protein Marker ;泳道 2 :ERl_Lll-pET21a/BL21 (DE3)诱导前；泳道 3 :ERl-Lll-pET21a/BL21 (DE3)诱导后；泳道 4 Lll-pET21a/BL21 (DE3)诱导前；泳道 5 :Lll-pET21a/BL21(DE3)诱导后；泳道6 BL21(DE3)诱导前；泳道 7 BL21(DE3)诱导后。图9是载体Lll- pET21a酶切鉴定电泳示意图；其中泳道I :DNA Marker DL5000 ；泳道 2 ER14-Lll-pET21a Bgl II单酶切。图 10 是重组菌 ER14-Lll-pET21a/BL21(DE3)诱导表达 Lll 蛋白 SDS-PAGE 示意图；其中泳道 I Protein Marker ;泳道 2 ER14-Lll-pET21a/BL21 (DE3)诱导前；泳道3 ER14-Lll-pET21a/BL21 (DE3)诱导后；泳道 4 Lll-pET21a/BL21 (DE3)诱导前；泳道 5 :Lll-pET21a/BL21(DE3)诱导后；泳道6 BL21(DE3)诱导前;泳道 7 :BL21 (DE3)诱导后。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普 通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。实施例I :构建Ll-CAT_pET21a增强子样序列检测载体
取云南省第一人民医院宫颈癌患者的肿瘤组织，按《精编分子生物学实验指南》(科学出版社)动物组织基因组DNA提取方法制备样品DNA基因组，经鉴定该样品属于人乳头瘤病毒 HPV58 型感染，使用引物 pv58pl: 5’ -ATGGTGCTGATTTTATGTTGCACCCT-3 ’ ；PV58P2: 5’ -TTATTTTTTAACCTTTTTGCGTTTG-3’，通过 PCR 扩增获得 HPV58 型 LI 基因，构建成 Ll_pMD18_T载体(PMD18-T载体购买于TAKARA公司，CK5601C)。重组质粒Ll_pMD18_T转化大肠杆菌DH5a (DH5a 购买于 TAKARA 公司，D9057)，并将 Ll-pMD18_T/DH5 a 菌株 37°C振荡培养 16h，然后使用质粒小量提取试剂盒(购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ZP101-2)抽提质粒，质粒抽提步骤按操作说明执行。氯霉素抗性基因CAT来自pACYC184载体(购买于New EngLand BioLabs 公司，VKN0287)，通过 PCR 扩增获得，其上游引物为 CAT Pl 5 ' -TAGCGCGGCCGCAGAGCTCATGGAGAAAAAAATCACTG -3 ^，其下游引物 CAT P2 5 ^ -CCGCTCGAGTTACGCCCCGCCCTGCCACTC _3入引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将PCR产物纯化回收，利用限制性内切酶I (购买于TAKALA，CKB701A)和沿ο I (购买于TAKALA，CK2401B)各IOU双酶切Iyg PCR产物37 °C过夜，通透琼脂糖凝胶试剂盒(购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ZP202-02)回收CAT基因，并且利用相同的酶切位点连接到pET21a(购买于Novagen，69740-3)，重组载体CAT_pET21a经酶切鉴定，测序验证载体构建正确(见图I)。质粒Ll-pMD18-T和质粒CAT-pET21a各IPg分别用IOU細H I (来源于TAKALA，CKB701A)和IOU Nde I (来源于TAKALA公司，CKB701A) 37°C酶切4h后，分别进行胶回收；取LI和CAT-pET21a酶切纯化片段各IOOng用T4 DNA连接酶(来源于TAKALA，CK5021B) μ 于20μ1体系中，16°C连接过夜；连接产物通过热休克法转化CaCl2制备的疋co7iDH5 α，转化产物涂布于Amp+-LB抗性平板上，37°C培养16h，挑单菌落接种与Amp+-LB抗性培养液中增菌后，使用粒抽提试剂盒提取质粒，用及I单酶切和及I ,Nde I双酶切鉴定重组质粒，琼脂糖凝胶电泳观察，获得了预期大小的片段(见图2)，经测序结果表明重组质粒Ll-CAT-pET21a 构建成功。实施例2 :重组菌抗氯霉素阈值和Ll-CAT融合蛋白表达水平检测取IOng增强子样序列检测质粒Ll-CAT-pET21a与ΙΟΟμΙ Ε· coLi BL21(DE3)(购买于Novagen公司，69450-3)感受态混匀，放置冰上30min，然后放入42°C水浴2min进行热休克，然后加入Iml LB培养液，37°C培养lh，离心弃掉大部分上清，涂布Amp+-LB固体培养皿中，于37°C培养12 16h，获得筛选菌株Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3);挑取该菌单菌落接种到Amp+-LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，第二天按1%分别接种到Amp+-LB液体培养基，振荡培养至0D600约为O. 5，将菌液稀释IO5倍和IO6倍，取ΙΟΟμΙ直接涂布在含有ImmoLIPTG、5(^g/ml Amp+以及氯霉素(Cam+)不同浓度梯度的双抗固体培养基上，经三次以上重复测定Ll-CAT-pET21a/BL21(DE3)重组菌株的抗氯霉素性阈值为在102Pg/mg(见表I氯霉素阈值检测结果)。另外，挑取将该菌单菌落接种到Amp+-LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，第二天按1%分别接种到Amp+-LB液体培养基，振荡培养0D_约为O. 6。诱导前取样，剩余培养液加入终浓度lmmol IPTG，37°C诱导表达4h后，取适当样品进行SDS-PAGE，检测融合蛋白Ll-CAT的表达水平，结果显示该蛋白的表达不明显(见图3)。实施例3 :基因组提取、酶切及构建文库
源于昆明市呈贡区居民生活污水和昆明市第四十三解放军总医院附近污水处理厂污水样品，经振荡混匀，取150μ1加入15ml牛肉膏蛋白胨液体培养基37°C振荡培养16h，培养液分装至IOml离心管，12000g离心2min，弃上清；细菌沉淀物加入2ml TE缓冲液，用移液枪反复吹打使之重悬，加入180μ1 10%的SDS和12μ1 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37°C温育 Ih ;加入 600μ1 5moL/L NaCl，充分混匀，再加入 400μ1 CTAB/ NaCl，于 65°C温育 IOmin ；加入等体积氯仿，充分混勻，12000g离心5min,上清转移至新的离心管；加入等体积的酹/氯仿，混勻，12000g离心5min,上清按700μ1每支I. 5ml离心管分装；加入等体积异戍醇，混匀，-40°C放置30min，12000g离心lOmin，去上清；沉淀先后用Iml 70%、100%乙醇各漂洗一次，在室温条件下待乙醇挥发完全，加入50μ1 TE缓冲液溶解沉淀，再加入2μ1 RNaseC5mg/ml)消化20min，基因组制备完成。取全基因组DNA IPg用限制性内切酶0. 5U SauSA I (购买于TAKALA，CKA1018) 于37°C部分酶解lh，胶回收500bp以下DNA片段(见图4);取基因组酶切回收产物10μ1和Ll-CAT-pET21a Bgl II酶切并用FastAP (来源于Fermentas，00087733)去磷酸化的回收片段300ng，用T4 DNA连接酶 μ 于16°C连接过夜；连接产物先经过乙醇沉淀纯化，通过电穿孔转化万.coli BL21 (DE3)感受态，电穿孔条件电压I. 8KV、电极杯1mm、电容2. 5 μ F、电阻200 Ω，电转化后立即加入900μ冰冷的SOC培养基混匀，于37°C振荡培养30min ;转化产物涂布于6个Amp+-LB抗性平板上，37°C培养16h，记录菌落生长数目，利用10ml Amp+-LB液体培养基将平板上菌落洗脱下来装入15ml离心管，即文库细菌，并保存于_40°C。实施例4 :含增强子样序列的菌株筛选及其抗生素增强活性测定
取保存的文库细菌10μ1，利用LB液体培养基进行10倍、100倍、1000倍、取1000倍稀释，取ΙΟΟμΙ涂布在含IPTG、5(^g/ml Amp+和102Pg/ml Cam+双抗LB固体筛选培养基，同时涂布新鲜培养的Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3)菌液20μ1于同样的筛选培养基平板中，作为对照，37°C培养24h，获得能够在高于抗生素阈值的单菌落，命名为ERl-Ll-CAT-pET21a/BL21 (DE3)，并挑取该单菌落在Amp+-LB培养基振荡培养过夜，并保存菌株。将利用氯霉素筛选出的菌株ERl-Ll-CAT_pET21a/BL21 (DE3)，采用与实施例2抗氯霉素阈值相同的测定方法，结果测出ERl-Ll-CAT-pET21a/BL21(DE3)的抗氯霉素阈值为17(^g/ml，抗生素抗性提高O. 6倍(见表I)。提取该菌株的质粒ERl-Ll-CAT-pET21a，用EcoR V (购买于TAKALA，CK502C)和I双酶切鉴定重组质粒是否插入基因序列，琼脂糖凝胶电泳观察，说明质粒载体插入500bp左右的基因片段(见图5)。
权利要求
1.一种增强外源蛋白表达的增强子样基因，其特征在于其具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列或其截短序列。
2.根据权利要求I所述的增强外源蛋白表达的增强子样基因截短序列，其特征在于截短序列为增强子样基因ERl任一长度的序列。
3.权利要求I或2所述的增强外源蛋白表达的增强子样基因在增强外源蛋白表达中的应用，其特征在于该基因插入到表达载体启动子上游和启动子下游的任意位置。
全文摘要
本发明公开了一种能够在原核细胞增强外源蛋白表达的增强子样基因ER1，该基因具有如SEQIDNO1所示的核苷酸序列或其截短序列，该基因序列通过构建融合表达报告基因重组载体筛选，融合报告基因由人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因和氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)组成，将待筛选基因片段和筛选重组载体进行连接、转化、构建基因文库，采用氯霉素抗性筛选出含有增强子样基因序列的重组菌株，从而获得增强子样序列，该序列能提高菌株融合报告基因氯霉素活性和促进外源蛋白表达。
文档编号C12N15/113GK102965375SQ20121049379
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者井申荣, 王应明, 曾韦锟, 黄芬 申请人:昆明理工大学