专利名称：骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的全反式维甲酸联合细胞因子诱导方法。
背景技术：
虽然骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗缺血性脑损伤固然已取得了一定的进展，但BMSCs移植后神经细胞转化率在体外可高达80%，在体内仅为3% 10%，而且在体内环境下分化为神经胶质细胞的比率较大而分化为神经元样细胞的比率较小，这无疑会给神经系统功能的恢复带来不利因素。如果能将骨髓基质细胞在体外分化为神经元样细胞，再行细胞移植会有事半功倍的效果。中胚层来源的BMSCs向外胚层来源的神经元分化的研究正处于起步阶段。全反式维甲酸是维生素A的衍生物，能够明显增加神经细胞的数量并呈剂量依赖效应，能调节EGF反应的神经干细胞分化，增加神经元细胞和星形胶质细胞的合成。将其与神经营养因子和细胞因子联合用于诱导胚胎干细胞向神经干细胞方向分化，同体内发育过程相似，且可以部分模拟体内环境，因此日益受到重视。但是，这些研究多停留在诱导后BMSC具有神经元形态特征和表达神经细胞标记物水平上，而缺乏具有神经细胞生理学特性的证据，因此许多学者认为这类细胞被称为“神经元样细胞”更为妥当。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其主要是利用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白；提示骨髓间充质干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。
具体的所述诱导方法包括如下步骤分离培养细胞，BMSCs的形态学观察，流式细胞仪检测抗原表达，诱导分化实验以及细胞免疫荧光染色。其中，所述的分离培养细胞步骤具体为在无菌条件下收集骨髓，肝素抗凝收集的骨髓悬液，D-Hanks液稀释，缓慢加在一半体积的Ficoll分离液上，600g离心15分钟，收集界面层细胞，用D-Hanks液洗I遍，调整细胞浓度为I X 105/ml，接种于25cm2的培养瓶，在饱和湿度静置培养，当细胞密度达到70%融合后用O. 25%的胰蛋白酶消化，按照I瓶分2瓶的比例传代培养；所述的BMSCs的形态学观察步骤具体为在倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，并摄片记录；所述的流式细胞仪检测抗原表达步骤具体为取2-3代培养细胞用O. 25%的胰蛋白酶消化后，用含I %小牛血清白蛋白PBS液调整细胞至5X 106/ml ;取50ul细胞悬液，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD34-FITC、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD 105-FITC、⑶106-FITC，置4°C孵育30分钟，PBS洗2次，进行流式细胞仪分析；所述诱导分化实验的步骤具体为取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60%时，换成诱导培养基，在37°C、5% CO2下饱和湿度静置培养；所述细胞免疫荧光染色的步骤具体为培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。本发明应用全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典 型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilament acidicprotein,GFAP);提示BMSCs仍然保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的全反式维甲酸联合细胞因子诱导方法的步骤流程示意图。
具体实施例方式如图1所示为本发明的骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的全反式维甲酸联合细胞因子诱导方法的步骤流程示意图，所述实施例的方法包括如下步骤S1.分离培养细胞所有操作均在无菌条件下进行，骨髓来源于髋关节手术时的松质骨碎片或下肢骨开放性手术时收集。肝素抗凝收集的骨髓悬液，D-Hanks液稀释(V V, I 1)，缓慢加在一半体积的Ficoll分离液(淋巴细胞分离液)上，600g离心15min，收集界面层细胞，D-Hanks液洗I遍，调整细胞浓度为lX105/ml，接种于25cm2的培养瓶，培养基为DMEM-LG (低糖DMEM培养基)+1% PeniciIIin-Str印tomycin (青链霉素双抗溶液)+10% FBS (胎牛血清)，37°C、5% CO2、饱和湿度静置培养。细胞密度达到70%融合后用O. 25%的胰蛋白酶消化，I瓶分2瓶的比例传代培养。S2. BMSCs的形态学观察在倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，并摄片记录。S3.流式细胞仪检测抗原表达取2-3代培养细胞用O. 25%的胰蛋白酶消化后，含I %小牛血清白蛋白的PBS (磷酸盐缓释液)调整细胞至5 X 106/ml ;取50111细胞悬液，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD34-FITC、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、⑶106-FITC，置4°C孵育30分钟，PBS洗2次，进行流式细胞仪分析。S4.诱导分化实验取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60%时，换成诱导培养基，所用诱导培养基为DMEM+10%FBS+1 μ mol/LATRA+20ng/ml bFGF+20ng/mlEGF，在37°C、5% CO2下饱和湿度静置培养。S5.细胞免疫荧光染色培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。贴壁细胞去培养基，用PBS洗3次，经4%的多聚甲醛固定30分钟，PBS洗涤3次，O. 3 %TritonX-1OO (聚乙二醇辛基苯基醚)处理20分钟，PBS漂洗3次，10%羊血清室温封闭20分钟,吸出血清,分别加入兔抗人NSE (神经元特异性烯醇化酶)(I 500)、GFAP (胶质纤维酸性蛋白)(1 1000)，37°C孵育2小时，然后PBS洗3次，加入羊抗鼠-FITC (I 500)孵30分钟；显色后在荧光显微镜下观察。实验结果及分析1. BMSCs的原代培养原代培养4小时后可见细胞贴壁，开始贴壁细胞呈单个分散，多为长梭状。3天后开始增殖，形态多样，一为梭形，带有2 3个较长的突起，细胞核圆形或椭圆形，有I 3个核仁；另有一种为宽阔扁平形或羽毛形,形状不规则,细胞核亦为圆形或椭圆形。其他有一些呈细小梭形、圆形等，量较少。后同形态细胞聚集并形成集落，5 7天后贴壁细胞开始融合，形成单层，其中梭形细胞排列具有一定的方向性。7 9天 后可见有80%以上细胞融合，呈漩涡状生长或成簇生长，随着细胞密度的增加，胞体变得细长，形态类似成纤维细胞。原代细胞生长较慢，长满瓶底需2-4周，在胎牛血清存在的条件下，传代细胞在3-5天左右可增殖一倍。培养的细胞可以稳定生长传代，而且体外培养10代以后，细胞的增殖速度无明显减慢。2. BMSCs的表面抗原特性流式细胞仪检测结果显示BMSCs表达⑶29、⑶44和⑶105，不表达⑶34、⑶45和CD106。3.诱导分化及免疫荧光染色结果加入诱导液2h后细胞形态即明显变化，光镜下BMSCs的细胞质向核收缩，呈典型的核周体形态。3 5h小时后多数细胞能形成神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网，但细胞数目无明显增加。3天后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态，伸出突触(类似轴突或树突)，部分细胞之间拉成网状，染色可见NSE、GFAP阳性。本发明应用全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白(glial fibri lament acidicprotein, GFAP);提示BMSCs保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1.一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其特征在于，其应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，所述诱导方法包括如下步骤分离培养细胞，BMSCs的形态学观察，流式细胞仪检测抗原表达，诱导分化实验以及细胞免疫荧光染色；其中， 所述的分离培养细胞步骤具体为在无菌条件下收集骨髓，肝素抗凝收集的骨髓悬液，D-Hanks液稀释，缓慢加在一半体积的Ficoll分离液上，600g离心15分钟，收集界面层细胞，用D-Hanks液洗I遍，调整细胞浓度为I X 105/ml，接种于25cm2的培养瓶，在饱和湿度静置培养，当细胞密度达到70%融合后用0. 25%的胰蛋白酶消化，按照I瓶分2瓶的比例传代培养； 所述的BMSCs的形态学观察步骤具体为在倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，并摄片记录； 所述的流式细胞仪检测抗原表达步骤具体为取2-3代培养细胞用0. 25%的胰蛋白酶消化后，用含I %小牛血清白蛋白PBS液调整细胞至5X 106/ml ;取50ul细胞悬液，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD34-FITC、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、⑶106-FITC，置4°C孵育30分钟，PBS洗2次，进行流式细胞仪分析； 所述诱导分化实验的步骤具体为取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60%时，换成诱导培养基，在37°C、5% CO2下饱和湿度静置培养；以及 所述细胞免疫荧光染色的步骤具体为培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。
2.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其特征在于，所述的分离培养细胞步骤中培养瓶中的培养基为DMEM-LG+1 %Penicillin-Streptomycin+10% FBS0
3.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其特征在于，所述的诱导分化实验步骤中所述诱导培养基为DMEM+10% FBS+1 u mol/LATRA+20ng/mlbFGF+20ng/ml EGF。
全文摘要
本发明提出一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，包括分离培养细胞，间充质干细胞的形态学观察，流式细胞仪检测抗原表达，诱导分化实验以及细胞免疫荧光染色。所述方法应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白；提示骨髓间充质干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。
文档编号C12N5/079GK103013916SQ20121050499
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者陆华 申请人:陆华