专利名称：嗜水气单胞菌核酸标准品的应用的制作方法
嗜水气单胞菌核酸标准品的应用技术领域
本发明主要涉及海产品疾病检测技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌核酸标准品的应用。
背景技术：
我国海域辽阔，自然条件优越，海洋资源十分丰富。但目前开发利用的程度还很低。这也说明我国开发利用海洋资源的潜力巨大，辽宁海域是中国重要的海洋生物资源、渔业资源宝库，其盛产水生动物、扇贝、贻贝、牡蛎和鱼、虾以及藻类等，带动海洋经济发展。加强多边和双边的海洋开发国际合作，集中集约开发利用海域及海岛资源，合理配置优势海洋产业，科学高效开发海洋资源，积极开展科研与试验、开发与利用，海水养殖标准化是合理开发海水养殖资源的重要手段，研究制定海产品养殖标准，合理开发海水滩涂养殖资源， 提高养殖海产品疾病是当今养殖业的重点内容。海产品养殖是一项高风险的养殖业，传统的小户的海产品养殖给养殖户带来了巨大的市场和技术风险。为了将养殖户养殖风险降到最低，开展对各类养殖业，包括鱼、虾、蟹、水生动物、鲍鱼、贝类、海藻等各类海产品的疾病防治工作任务举足轻重。有报道称，霍乱弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌等有害细菌，是引起海产品各种疾病的罪魁祸首。
嗜水气单胞菌(A. hydrophila)广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。该菌是弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽胞和荚膜，刚从病灶上分离的病原菌常两个相连。在普通琼脂平板培养基上进行培养形成的菌落园形、边缘光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略带淡桃红色有光泽，发育良好。嗜水气单胞菌在水温14. O 40. 5°C范围内都可繁殖，以28. O 30. (TC为最适温度。PH值在6 11范围内均可生长；最适PH值为7. 27 ;嗜水气单胞菌可在含盐量0%。 4%。的水生存，最适盐度为O. 5%。。嗜水气单胞菌可以产生毒性很强的外毒素，因嗜水气单胞菌的变异菌株较多，所以要特别注意疗效。发明内容
由背景技术可见，提高嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的检出率,增强其检测精度是解决多种水生动物病害问题的重要途径。本研究采用以下技术方案实现嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，其包括下述步骤
采用CTAB法提取样品的核酸；以嗜水气单胞菌核酸标准品作为阳性对照，对提取的样品核酸进行PCR特异性扩增^PCR特异性扩增产物进行电泳，对比样品和阳性对照的结果判断结果；
所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤
将提取的嗜水气单胞菌ATCC 35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966的基因组核酸经冷冻干燥后获得，其中所述的冷冻干燥条件为启动冻干机，当干燥室温度降至_35°C 时开启冷却阱；冷却阱温度降至_40°C时，将在_80°C预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr结束冷冻；并将样品于15°C干燥，当真空度降至O.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于_20°C中避光贮存。
对于上述技术方案中所述的样品的核酸提取方法，可以由本领域技术人员根据共知常识确定。
在上述技术方案中，所述的提取样品核酸的方法为步骤(3)，所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤
(I)增菌从嗜水气单胞菌标准菌株接种到普通LB培养基中，进行发酵，37°C培养12h制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，32 37°C培养 24 48h，至菌悬液菌含量的终浓度为IO7 101QCfu/g ；
所述的嗜水气单胞菌培养基，其配制方法如下胰 蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠IOg,葡萄糖5g,无需调节pH, 121°C下灭菌20min ;冷却备用；
(2)洗涤将步骤(I)获得的菌悬液重复下述操作2飞次以清洗，以1:10的体积比与PBS缓冲液充分混合，在800(Tl2000rpm条件下离心5 lOmin，收集菌体；
(3)采用CTAB法提取菌悬液DNA ;将提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，获得基因组核酸溶液；其操作步骤参见国家海洋局908专项办公室编，海洋生物生态调查技术规程，海洋出版社，2006、4，p23-26，于西林瓶中分装核酸样品；
(4)冷冻干燥启动冻干机，当干燥室温度降至_35°C时开启冷却阱；冷却阱温度降至_40°C时，将在_80°C预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr 结束冷冻；并将样品于15°C干燥，当真空度降至O.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于-20 V中避光贮存。
对于以上所述的所有技术方案中，所述的嗜水气单胞菌标准菌株为嗜水气单胞菌 ATCC35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966 ；
对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下提取的DNA用紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值，当0D26(l/0D28(l比值在1. 7 1. 9之间较佳；
对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下所述的PCR特异性扩增的条件为
上游引物5 ’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3，
下游引物5 ’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3
PCR 扩增反应体系(25 μ L)为:2· 5μ L 的 IOX 缓冲液 Buffer ;1μ L 的MgC12 ;1μ L 的 dNTPMix ;lyL 的引物 Pl (20mM) ;1 μ L 的引物 P2 (20mM) ;0· 2 μ L 的 TaqDNA 聚合酶； 18. 3 μ L超纯水；
PCR反应条件为94°C预变性IOmin ;然后94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 45s，循环30次；并于72°C延伸IOmin ；
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压6V/cm，电泳20分钟。
本发明中，上述产品制备方法中，均未限定方法的其他等效条件，因其可根据现有技术确定，也未限定所用试剂的级别，因其对结果影响小，并可以通过配制或商业途径购买获得，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。
本发明的优点是适用于水生动物的疾控或检测；本标准品的处理过程简单，耗时少；制备成本低，本发明粉剂保存时间长，不易污染。本发明对解决水生动物养殖的嗜水气单胞菌病的防治具有重要的现实意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
嗜水气单胞菌标准菌株选择嗜水气单胞菌ATCC 35654 ；
(I)增菌从嗜水气单胞菌标准菌株接种到LB培养基中，进行发酵，37°C培养1此制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，37°C培养48h，至菌悬液菌含量的终浓度为109cfu/g ；
所述的嗜水气单胞菌培养基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 葡萄糖5g,无需调节pH, 121°C下灭菌20min ；
(2)洗涤将步骤(I)获得的菌悬液重复下述清洗操作3次，以1:10的体积比与 PBS缓冲液充分混合,在12000rpm条件下离心5min,收集菌体；
(3 )采用CTAB法提取菌悬液DNA
取菌体加ρΗ8· O的TE悬浮，加O. 5mL浓度为100g/L SDS和30 μ L浓度为30mg/mL 的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ;加2mL浓度为5mol/L NaCl，混匀，加1. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65°C温浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ； 取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ;其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 1 ;取上清，加与上清等体积的氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心 IOmin ;其中，氯仿-异戍醇混合液中氯仿异戍醇的体积比为24 1 ;取上清，加上清0. 6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ;取沉淀，用 70%乙醇清洗2次，干燥，将提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，提取的样品DNA用紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 8之间的样品DNA于西林瓶中分装核酸样品；
(4)冷冻干燥启动冻干机，当干燥室温度降至_35°C时开启冷却阱；冷却阱温度降至_40°C时，将在_80°C预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0. 5Torr 结束冷冻；并将样品于15°C干燥，当真空度降至0.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于-20 V中避光贮存。
实施例2
嗜水气单胞菌标准菌株选择嗜水气单胞菌ATCC 7966 ；
(I)增菌从嗜水气单胞菌标准菌株接种到LB培养基中，进行发酵，37°C培养1此制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，35°C培养48h，至菌悬液菌含量的终浓度为108cfu/g ；
所述的嗜水气单胞菌培养基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 葡萄糖5g,无需调节pH, 121°C下灭菌20min ；
(2)洗涤将步骤(I)获得的菌悬液重复下述清洗操作2次，以1:10的体积比与 PBS缓冲液充分混合,在12000rpm条件下离心IOmin,弃上清,收集菌体；
(3 )采用CTAB法提取菌悬液DNA
取菌体加ρΗ8· O的TE悬浮，加O. 5mL浓度为100g/L SDS和30 μ L浓度为30mg/mL 的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ;加2mL浓度为5mol/L NaCl，混匀，加1. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65°C温浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 O. 7mol/L NaCl ； 取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ;其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 1 ;取上清，加与上清等体积的氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心IOmin ;其中，氯仿-异戍醇混合液中氯仿异戍醇的体积比为24 1 ;取上清，加上清O. 6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ;取沉淀，用 70%乙醇清洗2次，干燥，将提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，提取的样品DNA用紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 8之间的样品DNA于西林瓶中分装核酸样品；
(4)冷冻干燥启动冻干机，当干燥室温度降至_35°C时开启冷却阱；冷却阱温度降至_40°C时，将在_80°C预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr 结束冷冻；并将样品于15°C干燥，当真空度降至O.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于-20 V中避光贮存。
实施例3
取疑似有嗜水气单胞菌的引起淡水养殖鱼类爆发败血症的水体中取样，提取样品核酸
(I)增菌无菌条件下以1:1的体积比取样并接种到LB培养基中进行发酵，37°C培养12h制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，35°C培养48h， 至菌悬液菌含量的终浓度为108cfu/g ；
所述的嗜水气单胞菌培养基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 葡萄糖5g,无需调节pH, 121°C下灭菌20min ；
(2)洗涤将步骤(I)获得的菌悬液重复下述清洗操作2次，以1:10的体积比与 PBS缓冲液充分混合,在12000rpm条件下离心IOmin,弃上清,收集菌体；
(3 )采用CTAB法提取菌悬液DNA
取菌体加ρΗ8· O的TE悬浮，加0. 5mL浓度为100g/L SDS和30 μ L浓度为30mg/mL 的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ;加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加1. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65°C温浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ； 取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ;其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 1 ;取上清，加与上清等体积的氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心IOmin ;其中，氯仿-异戍醇混合液中氯仿异戍醇的体积比为24 1 ;取上清，加上清0. 6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ;取沉淀，用 70%乙醇清洗2次，干燥，将提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，提取的样品DNA用紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 8之间的样品DNA用于 PCR检测；
利用嗜水气单胞菌ATCC 35654核酸标准品作为阳性对照；对待测样品进行PCR特异性扩增，采用现有技术中公开的嗜水气单胞菌的保守基因16SrDNA部分序列特异性引物完成扩增
上游引物5 ’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3 ’
下游引物 5 ’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3
PCR 扩增反应体系(25 μ L)为:2· 5μ L 的 IOX 缓冲液 Buffer ;1μ L 的MgC12 ;1μ L 的 dNTPMix ;lyL 的引物 Pl (20mM) ;1 μ L 的引物 P2 (20mM) ;0· 2 μ L 的 TaqDNA 聚合酶； 18. 3 μ L超纯水；
PCR反应条件为94°C预变性IOmin ;然后94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 45s，循环30次；并于72°C延伸IOmin。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压6V/cm，电泳20分钟，从电泳图中条带的位置分辨待测样品中是否含有嗜水气单胞菌；电泳结果显示带检样品与标准菌株一样， 均在目的条带686bp处呈现阳性扩增，且条带单一，亮度较好，此结果证明带检样品中含有嗜水气单胞菌。
利用本发明实施例f 2所述方法制得的嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，适用于水生动物的疾病预防 ；处理过程简单，耗时少；制备成本低，本发明粉剂保存时间长，无污染。本发明对解决大批量水生动物养殖的嗜水气单胞菌的防治具有重要的现实意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，其特征在于，其包括下述步骤CTAB法提取样品的核酸；以嗜水气单胞菌核酸标准品作为阳性对照，对提取的样品核酸进行PCR特异性扩增J^PCR特异性扩增产物进行电泳，对比样品和阳性对照的结果判断结果;所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤将提取的嗜水气单胞菌ATCC 35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966的基因组核酸经冷冻干燥后获得，其中所述的冷冻干燥条件为启动冻干机，当干燥室温度降至_35°C时开启冷却阱；冷却阱温度降至_40°C时，将在_80°C预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空； 待真空度降至O. 5Torr结束冷冻；并将样品于15°C干燥，当真空度降至O.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于_20°C中避光贮存。
2.根据权利要求1所述核酸标准品的应用，其特征在于，所述的基因组核酸的提取方法为CTAB法提取嗜水气单胞菌ATCC 35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966的菌悬液DNA， 并将提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，提取的样品DNA用紫外分光光度计测260nm和 280nm处的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 7 1. 9之间的样品DNA于西林瓶分装。
3.根据权利要求1所述核酸标准品的应用，其特征在于，所述的菌悬液培养方法为(1)增菌从嗜水气单胞菌标准菌株接种到LB培养基中，进行发酵，37°C培养12h制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，32 37°C培养24 48h，至菌悬液菌含量的终浓度为IO7 101(lCfu/g ；所述的嗜水气单胞菌培养基配制方法胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化钠IOg,葡萄糖5g，无需调节pH, 121°C下灭菌20min ；(2)洗涤将步骤(I)获得的菌悬液重复下述清洗操作2飞次，以1:10的体积比与PBS 缓冲液充分混合，在800(Tl2000rpm条件下离心5"l0min,收集菌体。
4.根据权利要求1所述核酸标准品的应用，其特征在于，所述的PCR特异性扩增的条件为上游引物 5 ’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3，下游引物 5’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3PCR扩增反应体系(25 μ L)为2. 5μ L的IOX缓冲液Buffer ;1μ L的MgCl 2 ;1μ L的 dNTPMix ；1 μ L 的引物 Pl(20mM)；l μ L 的引物 P2(20mM)；0. 2 μ L 的 TaqDNA 聚合酶；18. 3μ L 超纯水；PCR反应条件为94°C预变性IOmin ;然后94°C变性30s，60。。退火30s，72。。延伸45s， 循环30次；并于72°C延伸IOmin ；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压6V/cm，电泳20分钟。
全文摘要
本发明公开一种嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，其包括下述步骤采用CTAB法提取样品的核酸；以嗜水气单胞菌核酸标准品作为阳性对照，对提取的样品核酸进行PCR特异性扩增；对PCR特异性扩增产物进行电泳，对比样品和阳性对照的结果判断结果；其中阳性对照通过将提取的嗜水气单胞菌ATCC 35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966的基因组核酸冷冻干燥获得基因组核酸标准样品，于-20℃中避光贮存。本发明产品适用于水生动物的疾病预防；制备成本低，保存时间长，无污染。对解决大批量水生动物养殖的嗜水气单胞菌的防治具有重要的现实意义。
文档编号C12Q1/04GK102994639SQ20121050872
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者王忠举 申请人:王忠举