专利名称：一种重组淀粉脱支酶发酵生产工艺的制作方法
一种重组淀粉脱支酶发酵生产工艺技术领域
本发明属于酶发酵工程技术领域，本发明涉及一种重组淀粉脱支酶高效可溶性表达的发酵生产方法。
背景技术：
淀粉脱支酶(E. C. 3. 2. I. 41)是一类能够水解支链淀粉、α _极限糊精等分子中 α -1，6葡萄糖苷键的淀粉水解酶。淀粉脱支酶通常和其它淀粉酶复配用于生产葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品。淀粉脱支酶可以切断淀粉中的分支点，加速后续酶的反应，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。目前能够在最适温度和最适PH上同时实现与糖化酶进行较好配合的商品化淀粉脱支酶主要是美国杰能科公司的OptimaxL-lOOO。我国虽然对淀粉脱支酶进行了大量的研究，但是还没有实现该酶的工业化生产，还需要依赖进口。
近年来国内外学者把淀粉脱支酶的开发研究作为非常重要的研究主题。Bunzo Mikami等对来源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脱支酶蛋白晶体结构进行解析,发现该酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(β/α)8桶状结构。近年来国外学者从极端嗜热微生物中分离出具有可以耐受接近100°C高温的淀粉脱支酶，但是这些酶往往只有在pH 6.0以上才具有较高的活性。R Koch等从Fervidobacterium pennavorans中分离到最适pH在4. 5 到5. 0，而且能够在70°C条件下具有较高稳定性的淀粉脱支酶。我国对淀粉脱支酶的研究虽晚于国外，但也有30多年的历史。早期工作主要围绕菌株的筛选。至上世纪90年代，我国市场上开始出售进口淀粉脱支酶，继而引发了对淀粉脱支酶在淀粉加工中的应用研究，并逐步推广到淀粉糖、酿造及其它发酵行业，带动了相关产业的技术提升。至2000年前后随着我国淀粉加工行业的快速发展，对淀粉脱支酶的需求激增，淀粉脱支酶生产菌株的开发逐渐升温。目前，我国科研人员先后在Bacillus、Thermotoga等微生物中筛选到一些性能优良的酶种，并开展了野生菌的诱变育种、酶的重组表达及发酵条件优化。唐宝英等人从土壤中分离出一株产淀粉脱支酶芽孢杆菌，通过诱变和产酶条件优化，酶活从I. 6U/mL提高到8. 8U/mL，该酶最适反应温度和pH分别为75°C和4. 6，在55°C反应条件下，在pH4. 0-8. O 范围内活性稳定。张明炎等将来源于地衣芽孢杆菌的淀粉脱支酶编码基因克隆大肠杆菌中进行表达，摇瓶发酵产酶最高达到6. 5U/mL。苏品等实现了来源于Thermotoga maritima 的淀粉脱支酶编码基因在枯草芽孢杆菌中的成功表达，该酶最适温度90°C，最适pH 6.0， 发酵酶活可达89. lU/mL。但是这些菌株的产酶水平仍然较低，生产成本高。2005年云南师范大学杨元娟等将B. naganoensis淀粉脱支酶克隆到P. pastoris中表达,酶产量可达到 350. 8U/mL。我们以重组大肠杆菌pulB/pET20b (+) /BL21 (DE3)为生产菌株，在工业级发酵培养基中连续流加甘油进行分批补料发酵，发酵后期通过添加Tween 80来促进活性蛋白聚集体解聚提高酶的分泌，发酵35小时，胞外酶活可达386U/mL (吴敬，陈晟，段绪果，陈坚 一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法.CN 201210035298.0)。除3了少数报道外，大多数的表达水平仍然较低。
综上所述，大多数微生物来源的淀粉脱支酶属于胞外酶，由于野生菌产酶能力较低，研究者大多尝试采用大肠杆菌或枯草杆菌表达系统分泌重组酶。然而，重组淀粉脱支酶由于自身性质决定了其极易活性蛋白聚集体，导致可溶性表达水平很低。因此有必要对发酵工艺进行改进来进一步提高淀粉脱支酶的表达及分泌水平，继续降低其生产成本低。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过增加淀粉脱支酶可溶性水平来提高淀粉脱支酶产量的方法，以解决现有发酵工艺中胞外酶活较低、生产成本高的问题。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下
一种重组淀粉脱支酶发酵生产工艺，以重组大肠杆菌是pulB/pET20b(+)/ BL21(DE3)为生产菌种(一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法· CN 201210035298. O)，具体过程如下
(I)种子制备将_80°C甘油管保存的菌株接入种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200rpm/min，培养温度37°C，初始pH值7. 10，培养时间8_10小时。
(2)发酵工艺将种子培养液接种入发酵培养基中，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持20-30 %，控制温度为30 ± I °C，流加质量浓度为25 %的氨水控制pH 7. O ± O. 5， 培养5-6小时，待溶氧上升至80-100%，以指数流加的方式补加补料液并调节转速及通风使溶氧维持在20-30%，发酵培养28-32小时。
(3)甘油补料发酵培养进行到4-5小后,通过补加500g/L的甘油补料液,使发酵液中甘油浓度维持在2_5g/L ；
(4)添加甜菜碱发酵过程中，采用一次性添加，分批添加或者流加方式，加入 5-200mmol/L的甜菜碱(发酵罐中的终浓度)。
(5)甘氨酸补料发酵培养6-7小时(OD6tltl为15_30)后,米用一次性添加的方式， 加入O. 5% -I. 5%甘氨酸(质量分数)。
(6)乳糖诱导发酵培养8-9小时，菌体吸光度OD6tltl达到45_60时，降温至 23-300C，通过补加浓度为200g/L乳糖溶液，使发酵液中乳糖残留浓度控制在4_6g/L。诱导 15小时左右，添加O. 1-1. 0%浓度的Tween 80，继续发酵1-10小时。
所述种子培养基的组成为工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL IOg/ L，pH 7. 10，种子培养基还可以添加100mg/L氨苄青霉素。
所述发酵培养基的组成为甘油6g/L，工业级蛋白胨12g/L，工业级酵母粉24g/L， KH2P042. 31g/L，K2HP043H20 16. 43g/L，微量元素液 10mL/L，发酵培养基还可以添加 100mg/L氨苄青霉素。
所述微量元素液为=FeSO4· 7H20 10g/L，ZnSO4 · 7H20 2. 25g/L，CuSO4 · 5H20 I. Og/ L, MnSO4 · 4H20 0. 5g/L, Na2B4O7 · IOH20,0. 23g/L, CaCl22. Og/L, (NH4)6Mo7O24O. lg/L。
所述补料液为甘油500g/L，MgSO4 · 7H20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L。
所述甘油补料液质量分数为50% (500g/L);甘油含量的测定方法采用HPLC : Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m),柱温 35°C，进样量10 μ L,差不折光检测器温度35°C,流速1. OmL/min，流动相纯水；发酵培养4小时后，每隔I小时,对发酵液中甘油浓度进行一次测定，根据测定结果加入一定体积的补料液，使发酵液中甘油浓度维持在 2-5g/L。
所述发酵液中乳糖浓度的测定方法参见GB/T 5413. 5-1997 ;每隔I小时，对发酵液中乳糖浓度进行测定，根据结果加入一定体积的乳糖诱导液，使发酵液中乳糖浓度维持在 4-6g/L。
酶活力测定方法分别取Iml的底物(O. 5%普鲁兰溶液)和O. 9ml O. IM ρΗ4· 5 的醋酸缓冲液于试管中，60°C水浴锅预热IOmin左右。加入O. Iml适当稀释的酶液样品，震荡混匀，反应体系总体积为2ml，反应30min (准确计时)，加入3mlDNS混匀、并立刻放入冰水中终止反应，之后沸水浴7min，冰水中冷却。上述反应体系中加入IOml的蒸馏水，混匀。 在540nm下测量其吸光值。
本发明采用添加甜菜碱结合其它发酵控制工艺(如分段控温发酵工艺、恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵控制工艺、诱导控制工艺和添加Tween 80),减少重组淀粉脱支酶的包涵体形成，实现了淀粉脱支酶高效可溶性表达，发酵结束后重组淀粉脱支酶酶活达到1400U/mL。
具体实施方式
实施例I
以本实验室构建的重组大肠杆菌是pulB/pET20b (+) /BL21 (DE3)为生产菌种(一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法.CN 201210035298. O)。
I、种子培养将_80°C甘油管保存的菌种接入种子培养基(工业级蛋白胨10g/L， 工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，100mg/L氨苄青霉素，pH 7. 10)中，使用恒温摇床进行培养转速200rpm/min，温度37°C，培养8小时。
2、发酵产酶
分批发酵阶段将种子液以8%接种量接入发酵培养基(甘油8g/L，蛋白胨Ig/ L，酵母粉 2g/L，KH2PO413. 5g/L，(NH4) 2HP044g/L，柠檬酸 I. 7g/L，MgSO4O. 68g/L，微量元素液 10mL/L,氨苄青霉素100mg/L)，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30 %，控制温度为 30°C，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 7. O，培养时间6个小时；
补料发酵阶段待溶氧上升至80-100%，批式培养结束后，以指数流加的方式补加以甘油为碳源的补料液(甘油500g/L，MgSO4 ·7Η20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)， 使菌体以0. 21Γ1的比生长速率进行生长，控制温度30°C，溶氧维持在30%，当菌体0D_达到15，采用一次性添加的方式，加入0. 75%甘氨酸(质量体积分数)，流加质量浓度为25% 的氨水控制pH 7. O ;
诱导培养阶段当菌体0D_达到50时，将温度降为25°C，溶氧维持在30%，连续补加0. 3g · L-1 · IT1乳糖,每5h降低10%的乳糖流速,通过补加浓度为200g/L乳糖溶液， 使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L。同时溶氧控制在20-30%，控制pH 7.040. 5，诱导 15小时左右，添加0.5%浓度的Tween 80，继续发酵5小时。发酵培养结束后，淀粉脱支酶活力达到386U/mL。
实施例2
具体过程如下本实验室构建的重组大肠杆菌是pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)为生产菌种(一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法.CN 201210035298. O)。
I、种子培养将_80°C甘油管保存的菌种接入种子培养基(工业级蛋白胨10g/L， 工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L, pH 7. 10)中，使用恒温摇床进行培养转速200rpm/min， 温度37°C，培养8小时。
2、发酵产酶
分批发酵阶段将种子液以8%接种量接入发酵培养基(甘油8g/L，蛋白胨Ig/ L，酵母粉 2g/L，KH2PO413. 5g/L，(NH4) 2HP044g/L，柠檬酸 I. 7g/L，MgSO4O. 68g/L，微量元素液 10mL/L)，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30%，控制温度为30°C，流加质量浓度为 25%的氨水控制pH 7. 0，培养时间6个小时；
补料发酵阶段待溶氧上升至80-100%，批式培养结束后，以指数流加的方式补加以甘油为碳源的补料液(甘油500g/L，MgSO4 ·7Η20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)， 使菌体以O. 21Γ1的比生长速率进行生长，控制温度30°C，溶氧维持在30%，当菌体0D_达到15，采用一次性添加的方式，加入O. 75%甘氨酸(质量体积分数)，流加质量浓度为25% 的氨水控制pH 7. O ;
诱导培养阶段当菌体0D_达到50时，将温度降为25°C，溶氧维持在30%，一次性添加20mmol/L的甜菜碱，同时连续补加O. 3g *L_1 *h_1乳糖,每5h降低10%的乳糖流速， 通过补加浓度为200g/L乳糖溶液，使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L。同时溶氧控制在 20-30%，控制pH 7. 0±0. 5，诱导15小时左右，添加O. 5%浓度的Tween 80，继续发酵5小时。发酵培养结束后，淀粉脱支酶活力达到1400U/mL。
权利要求
1.一种淀粉脱支酶的发酵生产方法，其特征在于以含有重组淀粉脱支酶编码基因的大肠杆菌为生产菌株，发酵工艺如下 将活化后的种子培养液接入发酵培养基中，通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持20-30%，控制温度为25-37 °C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，培养5_6小时； 待溶氧上升至80-100%，以指数流加的方式补加补料液使溶氧维持在20-30%，温度维持在25-37°C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，在发酵过程中添加适量的甜菜碱，当菌体OD600达到15-30时补加0. 75-1. 5% (m/V)的甘氨酸； 继续培养至菌体吸光度0D_达到45-60时，通过补加乳糖溶液，使发酵液剩余乳糖浓度控制在4-6g/L ;同时溶氧控制在20-30%，控制pH 7. 0±0. 5，诱导5_20小时，添加吐温80后再继续发酵1-10小时。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述甜菜碱的添加量为5-200mmol/L。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述甜菜碱的添加方式为一次性添加，分批添加或者连续流加。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述甜菜碱的添加时机为Oh-对数生长后期。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述Tween80的添加量为l_10g/L。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于种子活化用培养基的组成为工业级蛋白胨 10g/L，工业级酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L, pH 7. 10。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为甘油6g/L，工业级蛋白胨12g/L，工业级酵母粉24g/L，KH2P042. 31g/L，K2HP043H20 16. 43g/L，微量元素液10mL/Lo
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述种子培养基中还含有氨苄青霉素，浓度为 100mg/L。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中还含有氨苄青霉素浓度为 100mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种淀粉脱支酶的发酵生产工艺，属于发酵工程技术领域。本发明采用重组大肠杆菌E.coLi BL21(DE3)为生产菌株，在工业级发酵培养基中连续流加甘油进行分批补料发酵，在发酵过程中添加甜菜碱，对数生长中期流加乳糖进行诱导，发酵后期添加Tween80促进酶的分泌，淀粉脱支酶酶活达到1400U/mL。采取本策略进行发酵实现了淀粉脱支酶的高效可溶性表达，大幅提高了脱支酶的生产强度。本工艺采用工业上常用的甘油、蛋白胨、酵母粉等原料进行生产，简单易行，适于大规模生产。
文档编号C12R1/19GK102978191SQ201210519218
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者吴敬, 段绪果, 陈晟, 陈坚 申请人:江南大学