专利名称：一种快速高效玉米线粒体dna的提取及纯化方法
技术领域：
本发明涉及的是一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法。
背景技术：
植物mtDNA提取方法，主要有密度梯度离心、差速离心等方法；密度梯度离心得到的线粒体DNA虽纯度高，但操作复杂、耗时，而且对材料的需求量大，同时mtDNA产率低， 且长时间高速离心对离心机亦要求很高；利用密度梯度离心法提取线粒体DNA实验结果如图I所示，其主带不清晰，条带弥散，污染严重，而且过程繁琐、耗时长；普通的差速离心虽然操作简单，但所提取的mtDNA纯度低、易降解，以及核DNA、RNA和蛋白质等杂质污染严重，不能满足后续研究工作的需要；高盐-蛋白酶K法提取线粒体DNA具有操作简单，所提取的mtDNA具有结构完整、纯度和产率较高等优点，能满足PCR分析、基因定位、克隆等分子操作的需要。发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法。
本发明的技术方案如下
一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法，包括以下步骤
(I)将玉米外植体分装至预冷的研钵中，按每克样4mL的比例加入预冷的提取缓冲液A，放入l_2g石英砂，研磨至匀浆；取3个IOmL的离心管分别编号为A、B、C，再取3个 2mL的离心管分别编号为D、E、F。
(2)用6层无菌纱布过滤匀浆液，将磨碎组织放回研钵中，按每克样2mL补加缓冲液A重新研磨并过滤,2次滤液合并。将滤液分装到A管中，500r/min离心IOmin,去除大片碎片组织；
(3)将上清液转移至B管中，2600r/min离心2次，分别为15和lOmin，去除叶绿体等质体；
(4)取上清液至C管中，10000 r/min离心15 min,弃上清,在沉淀中加入I mL 预冷的A液,用枪头轻轻吹起沉淀,混勻。1000r/min离心IOmin,将上清吸入D管中，加入 1/500倍体积的100mg/mL DNaseI和1/100倍体积的lmol/L MgCl20冰浴Ih后加入1/25 倍体积的0. 5mol/L Na2EDTA,静置10 min，终止DNaseI反应；
(5) 13200r/min离心15min,去上清,得到线粒体沉淀,再加ST液纯化I次,得到纯化的线粒体；
(6) D管沉淀中加ImL裂解液B悬浮沉淀，再加入25mg/mL蛋白酶K 2·5μ ，50τ 温育I h，37°C再温育lh，期间间隔摇动；
(7)取出离心管室温放置，待其冷却后，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例为25 :24 :1，充分混匀，放在摇床上摇动15min，10000 r/min离心10 min ；
(8)转上清液至E管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例为24 :1，上下颠倒摇勻约IOmin, 10000 r/min离心10 min ；
(9)将上清液转移至F管中，然后加入1/100体积10mg/mL的RNaseA和1/500体积的 1000U/ μ L 的 RNaseT1JTt^KS I 小时，去掉 RNA ；
(10)加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例24 :1，上下颠倒摇匀约 IOmin, 10000 r/min 离心 10 min ；
(11)取上清液至I. 5mL的离心管中加入预冷的O. I倍体积NaAc和2倍体积无水乙醇，-20°C过夜；
(12) 4°C、13200r/min离心15min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤2 3次；
(13)沉淀于空气中干燥后溶入少量水中，-20°C冷藏备用。
其中所用的试剂
(I)缓冲液 A:lmol/L Tris-HCl 12. 5mL、0. 5mol/L Na2EDTA 12.5mL、1.3 mol/ L NaC l 15. 743g，用灭菌双蒸水定容至250mL，高温高压灭菌，室温保存。使用前添加O. 5g 85八、0.1258半胱氨酸、75(^1^ β-巯基乙醇。
(2) ST 液蔗糖 13. 6916g，lmol/L Tris-HCl 5mL，O. 5mol/L Na2EDTA 5mL，用灭菌双蒸水定容至lOOmL，高温高压灭菌，室温保存。使用前添加0. Ig BSA。
(3)裂解液 B: lmol/L Tris-HCl 2. 5mL,0. 5mol/L Na2EDTA 4mL, 10% SDS 5mL，用灭菌双蒸水定容至IOOmL，室温保存。
本发明的有益效果
(I)本实验在提取过程中，采用两种RNA酶RNase A和RNase T1同时处理，可完全去除RNA的污染。
(2) MgCl2 具有 DNaseI buffer 的作用，可替代 DNaseI buffer,降低成本。
(3) mtDNA的产出率得到明显提高。
图I为利用密度梯度离心法提取线粒体DNA实验结果；
图2为采用本发明的方法提取线粒体DNA实验结果；具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
(I)将玉米外植体分装至预冷的研钵中，按每克样4mL的比例加入预冷的提取缓冲液A，放入l_2g石英砂，研磨至匀浆；取3个IOmL的离心管分别编号为A、B、C，再取3个 2mL的离心管分别编号为D、E、F。
(2)用6层无菌纱布过滤匀浆液，将磨碎组织放回研钵中，按每克样2mL补加缓冲液A重新研磨并过滤,2次滤液合并。将滤液分装到A管中，500r/min离心IOmin,去除大片碎片组织；
(3)将上清液转移至B管中，2600r/min离心2次，分别为15和lOmin，去除叶绿体等质体；
(4)取上清液至C管中，10000 r/min离心15 min,弃上清,在沉淀中加入I mL 预冷的A液,用枪头轻轻吹起沉淀,混勻。1000r/min离心IOmin,将上清吸入D管中，加入 1/500倍体积的100mg/mL DNaseI和1/100倍体积的lmol/L MgCl20冰浴Ih后加入1/25 倍体积的0. 5mol/L Na2EDTA,静置10 min，终止DNaseI反应；
(5) 13200r/min离心15min,去上清,得到线粒体沉淀,再加ST液纯化I次,得到纯化的线粒体；
(6) D管沉淀中加ImL裂解液B悬浮沉淀，再加入25mg/mL蛋白酶K 2. 5 μ L, 50°C 温育I h，37°C再温育lh，期间间隔摇动；
(7)取出离心管室温放置，待其冷却后，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例为25 24 :1，充分混匀，放在摇床上摇动15min，10000 r/min离心 10 min ；
(8)转上清液至E管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例为24 :1，上下颠倒摇勻约IOmin, 10000 r/min离心10 min ；
(9)将上清液转移至F管中，然后加入1/100体积10mg/mL的RNaseA和1/500体积的1000U/ μ L的RNaseTJTt水浴I小时，去掉RNA ；
(10)加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例24 :1，上下颠倒摇匀约 IOmin, 10000 r/min 离心 10 min ；
(11)取上清液至I. 5mL的离心管中加入预冷的0. I倍体积NaAc和2倍体积无水乙醇，-20°C过夜；
(12) 4°C、13200r/min离心15min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤2 3次；
(13)沉淀于空气中干燥后溶入少量水中，_20°C冷藏备用。
试剂
(I)缓冲液 A:lmol/L Tris-HCl 12. 5mL、0. 5mol/L Na2EDTA 12.5mL、1.3 mol/ L NaCl 15. 743g，用灭菌双蒸水定容至250mL，高温高压灭菌，室温保存。使用前添加0. 5g 85八、0.1258半胱氨酸、75(^1^ β-巯基乙醇。
(2) ST 液蔗糖 13. 6916g，lmol/L Tris-HCl 5mL，0. 5mol/L Na2EDTA 5mL，用灭菌双蒸水定容至lOOmL，高温高压灭菌，室温保存。使用前添加0. Ig BSA。
(3)裂解液 B: lmol/L Tris-HCl 2. 5mL,0. 5mol/L Na2EDTA 4mL, 10% SDS 5mL，用灭菌双蒸水定容至IOOmL，室温保存。
如图2所示，可看出在点样孔附近无大分子DNA污染和前端有RNA污染。用核酸蛋白仪测定其0D26Q/0D28Q和浓度，结果显示0D26Q/0D28Q均在I. 8-2. O之间，表明mtDNA纯度较闻，蛋白质污染较少。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将玉米外植体分装至预冷的研钵中，按每克样4mL的比例加入预冷的提取缓冲液 A，放入l_2g石英砂，研磨至匀浆；取3个IOmL的离心管分别编号为A、B、C，再取3个2mL 的离心管分别编号为D、E、F;(2)用6层无菌纱布过滤匀浆液，将磨碎组织放回研钵中，按每克样2mL补加缓冲液A 重新研磨并过滤，2次滤液合并；将滤液分装到A管中，500r/min离心IOmin,去除大片碎片组织；(3)将上清液转移至B管中，2600r/min离心2次，分别为15和lOmin，去除叶绿体等质体；(4)取上清液至C管中，10000r/min离心15 min,弃上清,在沉淀中加入I mL预冷的 A液，用枪头轻轻吹起沉淀，混匀；1000r/min离心lOmin，将上清吸入D管中，加入1/500倍体积的100mg/mL DNaseI和1/100倍体积的lmol/L MgCl2 ;冰浴Ih后加入1/25倍体积的 0. 5mol/L Na2EDTA,静置 10 min，终止 DNaseI 反应；(5)13200r/min离心15min,去上清,得到线粒体沉淀,再加ST液纯化I次,得到纯化的线粒体；(6)D管沉淀中加ImL裂解液B悬浮沉淀，再加入25mg/mL蛋白酶K 2. 5 μ L, 50°C温育 I h,37°C再温育lh,期间间隔摇动；(7)取出离心管室温放置，待其冷却后，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例为25 24 :1，充分混匀，放在摇床上摇动15min，·10000 r/min离心10 min ；(8)转上清液至E管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例为 24 :1，上下颠倒摇勻约IOmin, 10000 r/min离心10 min ；(9)将上清液转移至F管中，然后加入1/100体积10mg/mL的RNaseA和1/500体积的 1000U/ μ L 的 RNaseTJTt水浴 I 小时，去掉 RNA ；(10)加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合液混合体积比例24:1，上下颠倒摇匀约 IOmin, 10000 r/min 离心 10 min ；(11)取上清液至I.5mL的离心管中加入预冷的0. I倍体积NaAc和2倍体积无水乙醇，_20°C过夜；(12)40C、13200r/min离心15min,弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤2 3次；(13)沉淀于空气中干燥后溶入少量水中，-20°C冷藏备用；其中所用的试剂(1)缓冲液A:lmol/L Tris-HCl 12. 5mL、0. 5mol/L Na2EDTA 12.5mL、1.3 mol/L NaCl 15. 743g，用灭菌双蒸水定容至250mL，高温高压灭菌，室温保存；使用前添加0. 5g BSA、·0.1258半胱氨酸、75(^1^ β-巯基乙醇；(2)ST 液鹿糖 13. 6916g, lmol/L Tris-HCl 5mL, 0. 5mol/L Na2EDTA 5mL,用灭菌双蒸水定容至lOOmL，高温高压灭菌，室温保存；使用前添加0. Ig BSA ；(3)裂解液B:lmol/L Tris-HCl 2. 5mL,0. 5mol/L Na2EDTA 4mL, 10% SDS 5mL，用灭菌双蒸水定容至IOOmL，室温保存。
全文摘要
本发明公开了一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法，将玉米外植体分装至预冷的研钵中，按每克样品4mL的比例加入预冷的提取缓冲液A，放入1-2g石英砂，研磨至匀浆；取3个10mL的离心管分别编号为A、B、C，再取3个2mL的离心管分别编号为D、E、F；在提取过程中，采用两种RNA酶RNase A和RNase T1同时处理，可完全去除RNA的污染。MgCl2 具有DNaseI buffer的作用，可替代DNaseI buffer，降低成本。采用本发明的方法，mtDNA的产出率得到明显提高。
文档编号C12N15/10GK102936592SQ20121051935
公开日2013年2月20日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者曹墨菊, 荣廷昭, 张艳花, 张晨, 汪静, 卢艳丽, 谢程程, 张采波, 徐浩, 徐东平, 黄 俊, 汪宏维, 兰海, 唐祈林, 吴元奇 申请人:四川农业大学