专利名称：集成基因代谢和重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法。
背景技术：
酒精浓醪发酵，简单来说就是发酵过程中的高浓度发酵，具体表现在生产有以下特点:1、高酒份；2、高渗透压；3、高酵母数。就酒精生产而言，不同原料、不同时期浓醪发酵的界限存在着明显的差别；大概区分如下:淀粉质原料:酒精浓度在14 16% (V/V)，糖蜜原料:酒精浓度在10 12% (V/V)0实现酒精浓醪发酵技术，可极大地提高设备利用率、减少工艺用水、降低蒸煮蒸馏能耗和生产成本，对提高乙醇生产的效率与经济和社会效益具有重要现实意义和应用价值。与常规酒精发酵相比，酿酒酵母在浓醪发酵过程中，不仅面临着更加严峻的环境胁迫(高渗、高酒精胁迫等)，还会因甘油、乙酸等副产物生成的增多而降低葡萄糖乙醇转化率。因此,为达到工业化生产对发酵速率、乙醇产量和糖醇转化率等技术指标的要求,选育副产物合成低并具有高耐性的工业酿酒酵母菌株是突破浓醪发酵技术瓶颈的关键所在。甘油是酿酒酵母发酵生产乙醇过程中主要的副产物，约消耗4% 10%的总碳源，如这些碳源用于生成乙醇，全球每年无需增加成本即可增产乙醇13亿升。目前，对酵母细胞甘油代谢途径已研究比较透彻，应用基因代谢工程技术对甘油合成相关的基因及途径进行修饰和改造，可以有效降低甘油的合成，但改造菌株在发酵过程中对高糖、高浓度乙醇等胁迫因子耐受性下降，生长缓慢，进而引起发酵速率降低、发酵周期延长及乙醇产量降低等不良现象。针对一个或少量基因调控、机制已知的性状，基因代谢工程方法是较容易和直接的可行性理性策略，但对于涉及多个基因及其调控网络的复杂性状(如发酵速率、耐受性等发酵性状)，基因代谢工程技术很难达到预期效果，甚至会引起菌株关键性能的退化衰变。目前，已有研究应用基于全基因组水平的盲目育种技术一全基因组重排，有效改良菌株的耐乙酸、耐高浓度乙醇等耐受性，但改造菌株的其他生产性能如糖醇转化率提高并不显著，而且随着醪液可发酵性碳源的增加，副产物合成也增加，极大限制了乙醇产量的提高。综上所述，应用单一的育种手段虽然能够改良菌株某一方面的性状，但很难获得性能全面的优良菌株，而且容易导致生产菌株关键性能的退化衰变。要从根本上突破浓醪发酵技术瓶颈，获得性能全面的 优良酿酒酵母菌株，还是需要结合不同的工业微生物育种策略优势，实现优劣互补，集成创新，更有效、快速地进行工业生产菌株的改良。
发明内容
本发明的目的是提供一种集成基因代谢工程与全基因组重排技术改良菌株多种生产性能的方法。本发明采用的技术方案是:一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法，所述方法包括:(1)诱导酿酒酵母菌株产孢，分离纯化单倍体菌株，鉴定单倍体菌株交配型，选取交配型a的单倍体菌株Yl和交配型α的单倍体菌株Υ2作为出发菌株；(2)然后分别敲除菌株Yl和菌株Υ2的编码甘油转运蛋白的基因FPSl，并在FPSl位点整合表达变链球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脱氢酶(GAPN),对单倍体Yl和Y2分别采用GMSlr和Zeolr抗性标记筛选，获得单倍体基因工程菌株:6418^抗性菌株 YFGl (MATa, fpsl Δ::PGKp_gapN)和 Zeor 抗性菌株 YFG2 (MAT a，fpsl Δ::PGKp-gapN)；(3)分别使用紫外和EMS对菌株YFGl和菌株YFG2进行诱变，获得四个突变库:YFGl紫外诱变库、YFG1EMS诱变库、YFG2紫外诱变库和YFG2EMS诱变库；(4)以体积浓度8%的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第一轮全基因组重排，用含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，诱导重排子产孢破壁后，用体积浓度12%的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第二轮全基因组重排，用含300 μ g/mLG418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，通过模拟工业原料的浓醪发酵测试,获得低副产物合成、高糖醇转化率和高乙醇产量的工业酿酒酵母工程菌株。所述甘油转运蛋白的氨基酸序列GenBank号NP_013057 ;所述变链球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脱氢酶(GAPN)的氨基酸序列的GenBank号为AAA91091o所述甘油转运蛋白的编码基因GenBank号NM_001181863 ;所述变链球菌(Streptococcus mutans)的3-憐酸甘油醒脱氧酶(GAPN)的编码基因GenBank号为L38521。由上述方法获得的一株低甘油合成、高酒精耐性的工业酿酒酵母菌株一酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FGl,提议的分类命名为:Saccharomyces cerevisiae FGl(MATa/a fpsl Δ::PGKl_gapN fpsl Δ::PGKl_gapN)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号=CCTCC No:M2011274，保藏日期:2011年8月1曰。所述酿酒酵母CCTCC No:M 2011274可用于微生物工业浓醪发酵生产酒精。具体为:将酿酒酵母CCTCC No:M 2011274接种至以双酶法配制的玉米糖化醪发酵液，30 35°C发酵60 80h，发酵结束后发酵液经分离纯化获得酒精。具体的，所述玉米糖化醪发酵液可按常规双酶法配制，本发明中具体如下:取玉米粉，加2 3倍质量的水调浆，搅拌加热至50 70°C，加入耐高温α -淀粉酶IOU 30U/g玉米粉，混匀后加热至80 90°C进行糊化液化，100 110°C保温0.5 2h ;糊化醪冷却至50 70°C，加入糖化酶100U 300U/g玉米粉，55 60°C糖化0.5 1.0h,即得所述玉米糖化醪发酵液。本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了一株具有副产物低、高酒精耐性的优良工业酿酒酵母工程菌株及其应用，以及一种改良工业菌株多种生产性能的方法——基因代谢工程与全基因组重排联用；运用此方法可改良酿酒酵母菌株的糖醇转化率、耐性、发酵速率等多种生产性能，改良菌株可用于工业浓醪酒精发酵生产，减少能耗，降低生产成本；此方法也可用于其它工业微生物性能的改良。
图1为G4181抗性的敲除FPSl整合gapN盒示意图；图2为Zeolr抗性的敲除FPSl整合gapN盒示意图；图3为全基因组重排流程图;其中Q为G418r抗性的基因工程菌株YFGI, 为Zeor抗性的基因工程菌株YFG2 ；图4为乙醇胁迫条件下菌株的生长曲线；(■，□)对照菌株Y12;(.，〇)基因工程菌株YFG12 ; ( ▲，Δ )基因工程重排子FGl ;图中空心图标为0% (ν/ν)乙醇胁迫条件；实心图标为10% (ν/ν)乙醇胁迫条件；图5为浓醪发酵性 能测试；㈩出发菌株Ζ87 ; ( □)对照菌株Υ12 ;(〇)基因工程菌株YFG12 ;(▲)基因工程重排子FG1。Α:残糖；B:乙醇。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:工业酿酒酵母甘油代谢工程菌株的获得1、单倍体出发菌株的获得将工业酿酒酵母Ζ87于30°C YPD活化后，转接入产孢培养基，在26°C培养3 7天。显微镜下观察其子囊孢子生成时收集菌体，生理盐水洗涤2次后，加入700 μ LTris-HCl (ρΗ8.0,0.0ImoI/L)、200 μ L100mg/mL 蜗牛酶溶液和 100 μ L0.lmol/L 巯基乙醇，120r/min在30°C培养16h，使子囊壁破裂释放孢子。58°C高温处理15min致死营养细胞，离心收集孢子，稀释涂布于YPD平板，30°C培养2 3天，挑取单菌落，YPD斜面活化后进行产孢验证，不能产孢者确定为单倍体菌株。待测菌株及标准菌株BY4741 (交配型α型)(ATCC201388)、BY4742 (交配型a型)(ATCC201389)分别接种于YPD液体培养基，30°C、200r/min培养过夜，取待测菌株培养液分别与两种标准菌株培养液混合，转接于新鲜YPD液体培养基中，30°C、100r/min培养，培养过程中镜检观察是否有哑铃形细胞产生，48h后离心收集，稀释涂布产孢基本培养，26°C培养3 7天，镜检观察有无子囊产生，如产生子囊孢子则认为杂交成功，可确定该单倍体交配型:能与a型标准菌株BY4742杂交的菌株其交配型为α ;能与α型标准菌株ΒΥ4741杂交的菌株其交配型为a。选取两株单倍体菌株Yl (交配型a型)和Y2 (交配型α型)作为后续育种的出发单倍体菌株，并将Yl和Υ2杂交获得二倍体菌株Υ12作为实验对照菌株。2、酿酒酵母甘油代谢工程菌株的构建(I)利用醋酸锂转化法，将6418^抗性的敲除FPSl整合gapN盒(图1)转化单倍体菌株Yl (交配型a型)，用含300 μ g/mL G418的YPD平板筛选得到工程单倍体菌株YFG1，基因型为(MAT a, fpsl Δ::PGKp-gapN);(2)利用醋酸锂转化法，将Zeolr抗性的敲除FPSl整合gapN盒(图2)转化单倍体菌株Y2 (交配型α型)，用含50 μ g/mL Zeocin的YPD平板(pH7.0)筛选得到工程单倍体菌株 YFG2，基因型为(MATa，fpSlA::PGKp-gapN);
(3)将YFGl和YFG2进行杂交，二者经液体YPD30°C培养24h后，混合培养于新鲜液体YPD培养2天后离心收集，稀释涂布于含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的YPD双抗平板(ρΗ7.0)，获得二倍体基因工程菌株YFG12(MAT a/α，fpsl Δ::PGKp-gapN, fpsl Δ::PGKp-gapN)。其中，步骤(I) (2)中敲除FPSl整合gapN盒中的FPSA和FPSB为同源整合区，克隆于酵母染色体DNA，FPSA为甘油转运蛋白编码基因FPSl ATG起始密码子上游-242到-51序列片段，FPSB为甘油转运蛋白编码基因FPSl的1906到2124序列片段；在FPSA和FPSB之间插入的PGK启动子(PGKp)和PGK终止子(PGKt)克隆于酵母染色体DNA，在启动子和终止子之间插入克隆于变链球菌染色体DNA的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapN，并将gapN基因的起始密码子TTG改为ATG ；其中步骤(I)中敲除FPSl整合gapN盒中的G418抗性基因(G418D作为筛选标记，克隆于质粒pUG6 (购于Invitrogen)。其中步骤(2)中敲除FPSl整合gapN盒中的Zeocin抗性基因(Zeolr)作为筛选标记，克隆于质粒pPICZ a A (购于Invitrogen)。实施例2:对基因工程菌株实施全基因组重排如图3所示流程实施全基因组重排，具体步骤如下:1、1% (v/v) EMS诱变剂分别对基因工程单倍体菌株YFGl (MATa, fpsl Δ::PGKp-gapN)和 YFG2 (MAT α，fpsl Δ::PGKp-gapN)处理 30 120min,每 30min取样加入5% (w/v)硫代硫酸钠去除EMS污染，4000rpm离心5min收集菌体，生理盐水洗涤两次，梯度稀释涂布含8% (v/v)乙醇的YPD板，30°C培养3天，挑取生长旺盛的单菌落；2、在距离为40cm，功率为15w的紫外灯下分别对基因工程单倍体菌株YFGl (MATa, fpsl Δ::PGKp-gapN) 和 YFG2 (MAT α，fpsl Δ::PGKp-gapN)进行紫外诱变，每隔 Imin 取样稀释涂布含8% (v/v)乙醇的YPD板平板，处理5min。处理过程所有操作必须在红灯下进行，防止光修复，平板用黑色的布包好，置于30°C培养3天，挑取生长旺盛的单菌落；3、将步骤I和2获得的诱变菌株进行杂交全基因组重排，分别经液体YPD30°C活化24h后，混合培养于新鲜液体YPD培养2天后离心收集，稀释涂布于含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的YPD双抗平板(pH7.0) 30°C培养3天筛选单菌落即为重排子；4、产孢培养基26°C培养步骤3挑取的重排子3 7天，生理盐水洗涤菌体后，加入700 μ L Tris-HCl (ρΗ8.0, 0.0 lmol/L)、200 μ L100mg/mL 蜗牛酶溶液和 100 μ L0.lmol/L 巯基乙醇，120r/min在30°C培养16h，使子囊壁破裂释放孢子，58°C高温处理15min致死营养细胞，离心收集孢子，稀释涂布于含12% (v/v)乙醇的YH)板平板，30°C培养3天，挑取单菌落后，重复步骤3进行第二轮重排；5、将步骤4获得的重排子，进行浓醪发酵测试，双酶法配制玉米糖化醪发酵液(约含葡萄糖250g/L)，重排子由YPD30°C培养15h后离心收集，按接种后菌体0D_=1.0的量接种至装有260g玉米糖化醪发酵液的锥形瓶，35°C发酵72h，采用多孔性阴离子树脂柱(Aminex HPX-87H column)经高效液相色谱测定醪液葡萄糖和乙醇含量，重排子FGl (BPCCTCC No:M 2011274)乙醇最高，产量达到117g/L，残糖低于5g/L。实施例3:工程菌株生产性能测定1、高浓度乙醇胁迫条件下的生长测定
分别用含0%和10% (v/v)乙醇YPD液体培养基30°C培养出发菌株Z87、对照菌株Y12、基因工程菌株YFG12、基因工程重排子FG1，不同时段取样测定菌株干重，计算菌株最大比生长速率。如图4所示，在含0%乙醇的YH)培养条件下，四个菌株生长无显著差异，延滞期均为0.4h左右；在含10% (v/v)乙醇的YPD培养条件下，四个菌株延滞期均延长至IOh左右，基因工程重排子FGl生长最快，最大比生长速率比Z87和Y12提高11.4%，比YFGl提高 21.9% (ρ〈0.05)。2、浓醪发酵性能测试模拟工业原料对对照菌株Υ12、基因工程菌株YFG12、基因工程重排子FGl (即CCTCC No:Μ 2011274)进行浓醪发酵测试。双酶法配制玉米糖化醪发酵液(约含葡萄糖250g/L):取玉米粉5kg，加IOL水调浆，搅拌加热至60°C，加耐高温α -淀粉酶(河南天冠企业集团有限公司)(20000U/mL) 3.8mL,混匀后加热至90°C进行糊化液化，105°C保温Ih ;糊化醪冷却至60°C，加糖化酶(河南天冠企业集团有限公司)(105U/mL)ll.3mL，55°C保温糖化Ih后，分装260g至500mL锥形瓶。菌株由YPD 30°C培养15h后离心收集，按接种后菌体OD6tltl=L O的量接种至装有200mL玉米糖化醪滤液的锥形瓶，35°C发酵72h，采用多孔性阴离子树脂柱(Aminex HPX-87Hcolumn)经高效液相色谱测定醪液葡萄糖、乙醇、甘油和乙酸含量。基因工程重排子FGl发酵速率最快(图5)，发酵72h残糖低于5g/L，已完成发酵，YFG12发酵速率较慢，与其具有较差的乙醇耐受力相一致。发酵结束72h时醪液中各成分含量见表1:重排子FGl乙醇最高，分别比出发菌株Z87、对照菌株Y12和基因工程菌株YFG12提高10.3%、7.9%和11.1%，糖醇转化率比Z87和Y12提高3.3%，与YFG12无显著差异；重排子FGl和YFG12的葡萄糖甘油转化率比出发菌株Z87降低14.7%，比对照菌株Y12降低15.5%，葡萄糖乙酸转化率比出发菌株Z87降低24.3%，比对照菌株Y12降低24.6%。可见，在浓醪发酵条件下，基因工程重排子FGl具有甘油、乙酸副产物合成低，发酵速率快,糖醇转化率高，乙醇产量高多种优良生产性能。表1:菌株发 酵性能测定
权利要求
1.一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法，所述方法包括: (1)诱导酿酒酵母菌株产孢，分离纯化单倍体菌株，鉴定单倍体菌株交配型，选取交配型a的单倍体菌株Yl和交配型α的单倍体菌株Υ2作为出发菌株； (2)然后分别敲除菌株Yl和菌株Υ2的编码甘油转运蛋白的基因FPSl，并在FPSl位点整合表达变链球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脱氢酶(GAPN),对单倍体I和Y2分别采用GMSlr和Zeolr抗性标记筛选，获得单倍体基因工程菌株:6418^抗性菌株YFGl和Zeolr抗性菌株YFG2 ； (3)分别使用紫外和EMS对菌株YFGl和菌株YFG2进行诱变，获得四个突变库:YFG1紫外诱变库、YFGl EMS诱变库、YFG2紫外诱变库和YFG2 EMS诱变库； (4)以体积浓度8%的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第一轮全基因组重排，用含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，诱导重排子产孢破壁后，用体积浓度12%的乙醇YH)平板筛选生长迅速的单菌落进行第二轮全基因组重排，用含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，通过模拟工业原料的浓醪发酵测试,获得低副产物合成 、高糖醇转化率和高乙醇产量的工业酿酒酵母工程菌株。
全文摘要
本发明提供了一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法，还提供了利用该方法获得的一株具有副产物低、高酒精耐性的优良工业酿酒酵母工程菌株及其应用；运用本发明方法可改良酿酒酵母菌株的糖醇转化率、耐性、发酵速率等多种生产性能，改良菌株可用于工业浓醪酒精发酵生产，减少能耗，降低生产成本；此方法也可用于其它工业微生物性能的改良。
文档编号C12N1/19GK103114048SQ201210527589
公开日2013年5月22日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者吴雪昌, 王品美, 郑道琼, 陶香林, 刘天喆 申请人:浙江大学