专利名称：鉴定大豆耐盐性的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定大豆耐盐性的分子标记及其应用。
背景技术：
土壤盐溃化是影响农业生产和生态环境的主要非生物因素之一，全球近1/5的耕地面积已受到盐溃化的影响。我国耕地面积中有近1/10是盐溃化土壤，近年来，不合理灌溉和塑料大棚面积扩大等农业措施加剧了土壤次生盐溃化。栽培大豆[Glycinemax(L.)Merr.]是我国重要的农作物之一，是植物蛋白和食用油的重要来源，属于中等耐盐植物。在 盐溃土地上种植大豆，其品质下降，产量下降甚至绝收。因此选育耐盐品种对于开发和利用盐溃化土壤具有重要意义。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。与其他几种遗传标记一形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定大豆耐盐性的分子标记及其应用。所述分子标记为如下I)或2)的分子标记I)分子标记A和分子标记B ；2)分子标记A ；所述分子标记A为用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的大小为145bp的分子标记；所述分子标记B为用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀NF58的基因组DNA得到的大小为166bp的分子标记。所述分子标记A和所述分子标记B是将所述PCR扩增的产物在5 — 7% (如6%)的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离得到的； 所述6%聚丙烯酰胺凝胶是指每配制IOOmL所述聚丙烯酰胺凝胶使用丙烯酰胺57g和双苯酰亚胺3克。本发明保护上述分子标记在大豆育种中的应用。本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定耐盐大豆的方法，包括用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增待测大豆的基因组DNA，若所述PCR扩增的产物为所述分子标记A，则所述待测大豆为耐盐大豆或候选为耐盐大豆；若所述PCR扩增的产物为所述分子标记B，则所述待测大豆为盐敏感大豆或候选为盐敏感大丑。
本发明保护上述方法在筛选耐盐大豆中的应用。
本发明保护上述方法在筛选盐敏感大豆中的应用。
在上述方法或应用中，所述耐盐大豆为盐害指数彡60. 0%的大豆品种或株系；所述盐敏感大 为盐吾指数> 60. 0%的大 品种或株系；
所述盐害指数的计算公式如下
… Σ(故$类別)(某-盐‘,丨 炎别株数)1ΛΛη/齡数(%) = U........................▲丽巧—_U00%
所述盐害类别分为5级1级为待测大豆植株有4片以上绿叶，2级为待测大豆植株有3片绿叶，3级为待测大豆植株有2片绿叶，4级为待测大豆植株有I片绿叶，5级为待测大豆植株仅心叶存活或死亡；
所述盐害类别的鉴定时期如下所述待测大豆植株第一个三出复叶完全展开时置于浓度为150mmol/L NaCl下培养至对照大豆品种Clark完全枯死。
在上述方法或应用中，所述待测大豆为大豆品种冀豆12号、冀NF58或由所述冀豆 12号和異NF58衍生的品种或品系。
在上述方法或应用中，所述由冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系为将所述冀豆12号和冀NF58杂交并繁衍至F2代以上的世代。
在本发明的实施例中，所述由冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系为以冀豆12 号为母本、冀NF58为父本的F6 : n重组自交系群体中的家系。
实验证明，与苗期盐害指数鉴定方法相比，用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对，PCR扩增待测大豆(以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F6 : n重组自交系群体的117个家系)的基因组DNA，通过得到的分子标记(分子标记 A和分子标记B)预测上述待测大豆耐盐性，准确率可达98. 2%。本发明可用于鉴定或筛选大豆品种或株系的耐盐性，大大提高了育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。
图I为PCR扩增待测大豆的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，从左自右依次为 大豆品种冀豆12号、冀NF58、以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的F6 : n重组自交系群体中的株系 3、7、8、13、17、19、22、25、27、28、30、32、35、36、41、42、43、44、45、46、49、50、56、57、 58、60、64、67、69、70、72、73、74、80、82、83、87、88、89、95、97、100、101、106、110、112、114、 I16、120、121、124、127、128、130、131、134、138、140、141、146、148、150、158、160、165、169、 170、171、174、176。
图2为PCR扩增待测大豆的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，从左自右依次为 大豆品种冀豆12号、冀NF58、以冀豆12号为母本、冀NF58为父本的^ : n重组自交系群体中的株系 1、4、5、9、10、14、15、16、24、26、33、37、38、40、48、53、63、71、75、76、78、79、81、 84、86、91、92、94、96、98、102、103、104、105、107、109、113、119、122、125、135、137、143、147、 161、173、175。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。大豆品种冀豆12号耐盐品种，河北冀丰农产品科技有限公司。大 品种異NF58 :盐敏感品种，河北異丰农广品科技有限公司。大豆品种Clark :盐敏感品种，文献蒋洪蔚等.大豆导入系群体芽期耐低温位点的基因型分析及QTL定位.作物学报.2009，7:1268-1273，公众可从河北省农林科学院粮油作物研究所获得。 实施例I、利用分子标记测定耐盐大豆品种冀豆12号和盐敏感大豆品种冀NF58I、利用SDS法提取耐盐大豆品种冀豆12号的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，取10 μ I PCR扩增产物，在95°C变性3min，立即放至冰上冷却，用6%聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)在90W恒功率下电泳分尚I. 5小时,获得大小为145bp的分子标记A。2、利用SDS法提取盐敏感大豆品种冀NF58的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，取10 μ I PCR扩增产物，在95°C变性3min，立即放至冰上冷却，用6%聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)在90W恒功率下电泳分尚I. 5小时，获得大小为166bp的分子标记B。上述步骤I和2的PCR扩增反应体系及反应条件如下反应体系(20μ1):4μ I 模板 DNA(30ng/y 1)，0·6μ I 引物(10 μ Μ)，I. 5 μ I dNTPs(2. 5mM),2. 0μ I 10XPCR Buffer (含 15mM Mg2+)，O. 2 μ I Taq 酶(5U/yl)和 11·7μ1ddH20。反应条件94°C预变性5min，循环阶段94°C变性30s ;47°C退火30s ;72°C延伸30s，循环35次，最后72°C延伸5min，PCR产物于4°C保存。6%聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)57克丙烯酰胺(Acrylamide),3克双苯酰亚胺(Bis),420克尿素(Urea)，100毫升10XTBE缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为tris108g/L、硼酸 55g/L、EDTA 7. 43g/L)，加 ddH20 至 1000 毫升。实施例2、利用分子标记预测冀豆12号和冀NF58衍生品系的耐盐性I、待测大豆 大 品种異 12号和異NF58的衍生品系以異 12号为母本、異NF58为父本的F6 π重组自交系群体的117个家系；对照耐盐大豆品种冀豆12号和盐敏感大豆品种冀NF58。2、分子标记检测及耐盐性预测分别取步骤I待测大豆的叶片(每个株系取10个单株的叶片混合)，利用SDS法提取基因组DNA,犾得119个待测大 的DNA样品,用序列表序列I所不的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对分别进行PCR扩增(方法同实施例1)，各取10μ I PCR扩增产物，在95°C变性3min，立即放至冰上冷却，在6%聚丙烯酰胺凝胶上90W恒功率下电泳分离I. 5小时，银染、显影后拍照，结果如图I和图2所示，记录数据(若为分子标记A，则判断该待测大豆为耐盐大豆，记为“A” ；若为分子标记B，则判断该待测大豆为盐敏感大豆，记为“B”)，结果如表I所示。
3、盐胁迫处理及耐盐性鉴定
I)盐胁迫处理
将步骤I待测大豆的每个株系取10粒种子播种于盛有砂土的花盆中，每个株系种植3盆(为I次重复)，并将花盆移至盛有l/2Hoagland营养液的平底塑料盒中，按照随机区组实验设计，在每个塑料盒中盛放8个花盆。10天后，待真叶完全展开，每个花盆中留取5 株长势一致的幼苗。待第一个三出复叶完全展开时，用含150mmol/LNaCl的1/2 Hoagland 营养液进行处理，每3天更换I次营养液，以盐敏感大豆品种Clark作为对照。试验设3次重复。
上述1/2 Hoagland 营养液的配方如下0. 5mmol/L Ca(NO3)2 · 4Η20、0· 5mmol/ LKN03、0. 2mmol/L NH4H2PO4 和 0. 25mmol/L MgSO4 · 7H20，0. 02mmol/L FeSO4 · 7H20 和 0. 02mmol/L Na2EDTA, 46 μ mol/L H3BO3>9 μ mol/L MnCl2 · 4H20、I μ mmol/L ZnSO4 · 7H20、 0. I μ mol/L (NH4) 6Mo7024 · 4H20 和 0. 4 μ mol/L CuSO4 · 5H20。
2 )苗期耐盐性评定(苗期盐害指数法)
经步骤I)的盐胁迫处理20天后，盐敏感大豆品种Clark完全枯死，此时对待测大豆植株进行盐害症状调查，计算盐害指数(取三个重复的平均值)，再根据盐害指数判断大豆的耐盐性，将盐害指数彡60. 0%的大豆品种或株系定义为耐盐大豆(记为“ + ”)，将盐害指数> 60. 0%的大豆品种或株系定义为盐敏感大豆(记为结果如表I所示。
上述盐害指数的计算公式
Σ(盐汲类别1某.盐古炎别株数)盐山4| I m%) =;—■■■■■7；—P;■■■■■■■■■■■■H■■■■■—I-X100%株数X 5
其中，盐害类别分为5级I级为待测植株有4片以上绿叶，2级为待测植株有3片绿叶，3级为待测植株有2片绿叶，4级为待测植株有I片绿叶，5级为待测植株仅心叶存活或死亡。
表I.待测大豆的耐盐性预测结果
权利要求
1.一种用于鉴定或辅助鉴定大豆耐盐性的分子标记，其特征在于所述分子标记为如下I)或2)的分子标记 1)分子标记A和分子标记B； 2)分子标记A； 所述分子标记A为用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的大小为145bp的分子标记； 所述分子标记B为用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀NF58的基因组DNA得到的大小为166bp的分子标记。
2.根据权利要求I所述的分子标记，其特征在于所述分子标记A和所述分子标记B是将所述PCR扩增的产物在5 — 7%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离得到的。
3.权利要求I或2所述分子标记在大豆育种中的应用。
4.一种鉴定或辅助鉴定耐盐大豆的方法，包括用序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的弓I物对PCR扩增待测大豆的基因组DNA，若所述PCR扩增的产物为所述分子标记A，则所述待测大豆为耐盐大豆或候选为耐盐大豆；若所述PCR扩增的产物为所述分子标记B，则所述待测大豆为盐敏感大豆或候选为盐敏感大豆。
5.权利要求4所述方法在筛选所述耐盐大豆中的应用。
6.权利要求4所述方法在筛选所述盐敏感大豆中的应用。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述待测大豆为大豆品种冀豆12号、冀NF58或由所述冀丑12号和冀NF58衍生的品种或品系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述由冀豆12号和冀NF58衍生的品种或品系为将所述冀豆12号和冀NF58杂交并繁衍至F2代以上的世代。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定大豆耐盐性的分子标记及其应用。所述分子标记为用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀豆12号的基因组DNA得到的大小为145bp的分子标记A；和/或，用序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成的引物对PCR扩增大豆品种冀NF58的基因组DNA得到的大小为166bp的分子标记B。本发明所提供的分子标记可用于大豆品种或株系的耐盐性鉴定或筛选，大大提高了育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/11GK102978289SQ20121053863
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者张孟臣, 史晓蕾, 闫龙, 闫玮雯, 杨春燕 申请人:河北省农林科学院粮油作物研究所