一种防治芝麻枯萎病的生防菌、分离方法、菌剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种防治芝麻枯萎病的生防菌、分离方法、该生防菌菌剂及其应用，其中该生防菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus?licheniformis）SF3-33，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏日期：2012年11月28日，保藏号：CCTCC?NO:M?2012488。本发明的分离方法是通过对荩草根系土壤进行微生物分离、对峙培养，分离得到防治芝麻枯萎病的生防菌。本发明分离得到的生防菌可以有效防治芝麻枯萎病同时促进芝麻植株的生长。将采用该生防菌制得的菌剂对芝麻植株灌根处理，芝麻植株的病害严重度最低可降至10%以下，防效可达80%以上，并具有明显的对芝麻植株的促生效果。
【专利说明】一种防治芝麻枯萎病的生防菌、分离方法、菌剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种防治芝麻枯萎病的生防菌，同时涉及该生防菌的分离方法、该生防菌菌剂及其应用，属于植物保护【技术领域】。
【背景技术】
[0002]芝麻(Sesamum indicum),隶属于胡麻科胡麻属，是世界上最古老的油料作物之一，也是我国重要的优质油料作物。我国芝麻年种植面积1200万亩左右，总产量约75万吨，在国际油料贸易中具有重要的地位。芝麻枯萎病是(Sesame Fusarium wilt, SFW)由尖孢镰刀菌芝麻专化型(Fusarium oxysporum f.sp.sesami (Zaprometoff)Castellani,FOS)病菌侵染引起的一种土传真菌病害。芝麻在全生育期均可被尖孢镰刀菌侵染。该病属于世界性病害，印度、苏丹、埃及和巴基斯坦等许多芝麻生产国每年均有不同程度发生。该病在我国主要发生在东北、华北、西北、黄淮以及江淮部分地区，常年发生率15%左右，严重发生时可达30%以上，常导致芝麻种子不成熟、籽粒瘦瘪，易在收获前炸落，严重威胁和阻碍着芝麻的生产与发展。由于芝麻种质资源遗传基础狭窄，目前未发现对枯萎病表现免疫的芝麻种质资源，高抗枯萎病材料比例亦较低，加之芝麻枯萎病属于土传病害，采用农业防治和化学药剂防治效果不够明显。至今，国内外对芝麻枯萎病尚无较好的防控技术方法。开发新型、高效和安全的微生物杀菌剂是芝麻枯萎病防控研究的重要方向，也是实现我国芝麻产业安全可持续发展的需要，符合社会发展需求。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种防治芝麻枯萎病的生防菌。
[0004]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种防治芝麻枯萎病的生防菌，所述生防菌为地衣芽孢杆菌(Bacillusl`icheniformis)SF3_33,保藏日期:2012年11月28日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号:CCTCC N0:M2012488o
[0005]本发明的目的还在于提供一种防治芝麻枯萎病的生防菌的分离方法。
[0006]本发明所采用的技术方案还在于提供一种防治芝麻枯萎病的生防菌的分离方法，包括以下步骤:
[0007]I)病原菌及土壤微生物的分离:
[0008]a)病原菌的分离:
[0009]取芝麻枯萎病发病植株，对芝麻植株的病杆进行消毒、清洗，再将病感中央维管束组织放入含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培养基上，在26_28°C条件下培养3_4d，然后将优势菌落在PDA培养基中培养3-4d后，进行单孢分离纯化，保存备用；
[0010]b) 土壤微生物的分离:
[0011]称取荩草根部土壤，加入无菌水，采用浓度梯度法稀释土壤悬液，取浓度梯度土壤悬液均匀涂布在1/10TSA培养平板上，在26-28°C条件下，倒置培养l_2d ;将生长出的菌落接种于TSA培养基进行分离纯化，然后将纯化的细菌与50%甘油等量混合_70°C冷冻保存备用；
[0012]2)拮抗菌筛选:
[0013]将培养的不同土壤细菌与尖孢镰刀菌芝麻专化型在PDK培养基上对峙培养，判断有无拮抗作用；
[0014]3 )对拮抗菌进行鉴定分类。
[0015]所述芝麻植株病杆为芝麻杆病健交界处的茎杆。
[0016]所述PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0017]所述1/10TSA 培养基为:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,琼脂 15g,蒸懼水 1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0018]所述TSA 培养基为:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,琼脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0019]所述PDK培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0020]本发明的目的还在于提供一种防治芝麻枯萎病的生防菌菌剂。
[0021]本发明所采用的技术方案还在于提供一种防治芝麻枯萎病的生防菌菌剂，将生防菌接种在LB液体培养基中，在30-33°C条件下振荡培养2-3d，离心，取沉淀加入无菌水即得。
[0022]所述LB液体培养基为:酵母提取物5g,蛋白胨IOg,氯化钠IOg,琼脂15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0023]本发明的目的还在于提供一种防治芝麻枯萎病的生防菌在促进芝麻生长方面的应用。
[0024]本发明所采用的技术方案还在于提供一种防治芝麻枯萎病的生防菌在促进芝麻生长方面的应用。
[0025]本发明通过对荩草根系土壤进行微生物分离、对峙培养，分离得到一种防治芝麻枯萎病的生防菌，该生防菌可以有效防治芝麻枯萎病同时促进芝麻植株的生长。将采用该生防菌制得的菌剂对芝麻植株灌根处理，芝麻植株的病害严重度最低可降至10%以下，防效可达80%以上，并具有明显的对芝麻植株的促生效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明的生防菌与尖孢镰刀菌芝麻专化型对峙培养；
[0027]图2为本发明的生防菌在培养平板上的菌落形态；
[0028]图3为本发明的生防菌对芝麻植株生长促进作用效果图，
[0029]图中，图3左:为本发明的温室盆钵试验生防菌对芝麻植株生长促进作用的效果图，
[0030]图3右:为本发明的大田盆钵试验生防菌对芝麻植株生长促进作用的效果图。【具体实施方式】[0031]芝麻枯病病原菌株HSFO 09100是河南省芝麻研究中心与2009年从河南省封丘鲁岗乡和寨村芝麻病株中分离得到，并由河南省芝麻研究中心植物病理研究室保存备用。
[0032]芝麻枯病病原菌株HSFO 10044是河南省芝麻研究中心与2010年从山西省晋中市榆次县芝麻病株中分离得到，并由河南省芝麻研究中心植物病理研究室保存备用。
[0033]荩草根部土壤为河南省西峡县云台村禾本科荩草根部土壤。
[0034]培养基的配制:
[0035]PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂粉15g，蒸馏水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌20min。
[0036]1/10TSA 培养基为:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,琼脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0037]TSA 培养基为:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,琼脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0038]PDK培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂15g，蒸馏水lOOOmL，ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0039]LB液体培养基为:酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
[0040]实施例1、病原菌的分离
[0041]在芝麻杆病健交界处用无菌切割刀将茎杆切成3cm的小段，75%酒精表面消毒30s, 3%次氯酸钠表面消毒5min，然后用无菌水冲洗4次；再用无菌切割刀把茎杆小段从中部纵切成两半，使维管束组织显露出来；轻轻镊取中央维管束组织，放于含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培养基上。26-28 °C`恒温箱中恒温保湿培养3d后，挑选出优势菌落PDA培养3d后，进行单孢分离纯化，并保存备用。
[0042]实施例2、土壤微生物的分离
[0043]取采集的荩草根部土壤lg，用无菌水梯度稀释至10_5_10_3g/mL，将稀释好的混合液均匀地涂布于1/10TSA培养平板上，于28°C恒温培养箱中倒置培养2d,待细菌菌落长出后，用无菌牙签挑取大小、颜色或形态不同的细菌在TSA培养基表面划线分离纯化。
[0044]实施例3、生防菌筛选
[0045]生防菌筛选采用平板对峙培养法，在PDK平板中央接尖孢镰刀菌菌块，离菌块25mm处接待测菌，置于26_28°C恒温箱培养6d，观察有无抑菌圈产生，并测量抑菌圈大小，如图1所示。
[0046]拮抗测试结果表明，荩草根系土壤中发现一种芝麻枯萎病生防菌，命名为SF3-33。
[0047]实施例4、生防菌形态学观察
[0048]生防菌SF3-33菌落白色，近圆形，直径2_3mm，表面干燥皱褶，不透明，较粘稠，易挑取，如图2所示。
[0049]实施例5、生防菌的鉴定分类
[0050]对筛选出的生防菌进行测序，鉴定结果为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。
[0051]16SrDNA 基因序列测定结果:gtgctagtacatgcagtcgagctgacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggc
【权利要求】
1.一种防治芝麻枯萎病的生防菌，其特征在于，所述生防菌为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) SF3-33，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号=CCTCC N0:M 2012488。
2.一种如权利要求1所述的防治芝麻枯萎病生防菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)病原菌及土壤微生物的分离: a)病原菌的分离: 取芝麻枯萎病发病植株，对芝麻植株的病杆进行消毒、清洗，再将病感中央维管束组织放入含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培养基上，在26-28 °C条件下培养3_4d，然后将优势菌落在PDA培养基中培养3-4d后，进行单孢分离纯化，保存备用； b)土壤微生物的分离: 称取荩草根部土壤，加入无菌水，采用浓度梯度法稀释土壤悬液，取浓度梯度土壤悬液均匀涂布在1/10TSA培养平板上，在26-28°C条件下，倒置培养l_2d ;将生长出的菌落接种于TSA培养基进行分离纯化，然后将纯化的细菌与50%甘油等量混合_70°C冷冻保存备用； 2)拮抗菌筛选: 将培养的不同土壤细菌与尖孢镰刀菌芝麻专化型在PDK培养基上对峙培养，判断有无拮抗作用； 3)对拮抗菌进行鉴定分类。
3.根据权利要求2所述的一种防治`芝麻枯萎病生防菌的分离方法，其特征在于，所述芝麻植株病杆为芝麻杆病健交界处的莖杆。
4.根据权利要求2所述的一种防治芝麻枯萎病生防菌的分离方法，其特征在于，所述PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
5.根据权利要求2所述的一种防治芝麻枯萎病生防菌的分离方法，其特征在于，所述1/10TSA 培养基为:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,琼月旨 15g,蒸懼水 1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
6.根据权利要求2所述的一种防治芝麻枯萎病生防菌的分离方法，其特征在于，所述 TSA 培养基为:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,琼脂 15g,蒸懼水 1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌 20min。
7.根据权利要求2所述的一种防治芝麻枯萎病生防菌的分离方法，其特征在于，所述PDK培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g，蛋白胨IOg,琼脂15g，蒸馏水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C湿热灭菌20min。
8.—种如权利要求1所述的防治芝麻枯萎病的生防菌菌剂，其特征在于，将生防菌接种在LB液体培养基中，在30-33°C条件下振荡培养2-3d，离心，取沉淀加入无菌水即得。
9.根据权利要求8所述的防治芝麻枯萎病的生防菌菌剂，其特征在于，所述LB液体培养基为:酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水lOOOmL，pH7.0-7.2，121 °C湿热灭菌20min。
10.一种防治芝麻枯萎病的生防菌在促进芝麻生长方面的应用。
【文档编号】C12R1/10GK103865824SQ201210538685
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月13日 优先权日:2012年12月13日
【发明者】张海洋, 苗红梅, 常淑娴, 段迎辉, 魏利斌 申请人:河南省农业科学院