专利名称：一种l-组氨酸高产菌及其应用的制作方法
技术领域：
一种L-组氨酸高产菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
L-组氨酸对婴幼儿是必需氨基酸，成人体内可和合成L-组氨酸，因此对成人是半必需氨基酸。L-组氨酸主要用于氨基酸输液及综合氨基酸试剂，心脏循环器官药品及消化道溃疡药，治疗贫血、风湿性疾病、过敏症等。L-组氨酸具有多种生理功能，广泛应用于医药、饲料及食品行业。目前国内主要是从猪血粉水解液中以离子交换工艺提取L-组氨酸，由于成本较高，水解损失率高，造成环境污染，不适合工业化生产，因此加快发酵法生产L-组氨酸迫在眉睫。·
发酵法生产L-组氨酸是通过诱变处理，选育结构类似物抗性、营养缺陷型或分支酶缺陷型突变株。国外在这方面起步较早。日本的清志中山和村田荒木以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，进行诱变，定向选育L-组氨酸结构类似物2-噻唑丙氨酸和1，2，4-三唑丙氨酸抗性突变株，打破了菌株正常代谢调节，产酸达6-8g/L(Agric BiolChem. 1971，35(13) :2081-2088)。后又将突变株诱变，得到嘌呤、嘧啶结构类似物抗性菌株，使产酸达到 15g/L(Agric Biol Chem. 1974，38(11) :2091-2096)。国内此方面研究起步较晚。曾莹等以黄色短杆菌为出发菌株，通过复合诱变得到的高产突变菌株可产L-组氨酸128. 28mg/L (氨基酸和生物资源，2005, 27(1) :46-48)。顾正华[21]等以谷氨酸棒杆菌为出发菌株进行诱变，选育D-组氨酸和6-氮鸟嘌呤抗性突变株，产酸1. 6g/L (无锡轻工大学学报.2002, 21 (5) : 533-535)。随着DNA重组技术的快速发展，人们开始利用分子生物学和微生物学手段进行菌种改造，改变微生物代谢途径，从而提高产量。日本的川岛利用枯草芽孢杆菌K的组氨酸产生菌AJ12111 DAN进行克隆，获得枯草芽孢杆菌互补质粒pAH3。从pAH3上切除包含hisj的基因片段，通过载体导入AJ12111，L-组氨酸产量从6. 3g/L提高到8. 8g/L(JMol Biol. 1988，203(3) :585-606)。仓桥修等将枯草芽孢杆菌诱变，得到L-组氨酸产生菌AJl 1733，培养至对数期，提取DNA。再将AJl 1733诱变得到缺陷型菌株AJl 1732，培养成为具有吸收DNA能力的细胞。将DNA导入AJl 1733，得到AJl 1734。从AJl 1734中提取L-组氨酸合成及拮抗体耐受基因，导入AJl 1733，得到高产菌株AJl 1735，产酸从I lg/L提高到23g/L (J. Bacteriol, 1987，169(2):823-829)。
发明内容
本发明的目的是提供一种L-组氨酸高产菌及其应用。本发明技术方案为一种L-组氨酸高产菌，于2012年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2012144，其分类学命名为粘质沙雷氏菌ZJZG25Serratia marcescens ZJZ G25,地址中国武汉,武汉大学。所述菌株具有3-氨基-1，2，4-三氮唑抗性，抗性浓度为2mg/mL。
所述菌株具有6-巯基嘌呤抗性,抗性浓度为3mg/mL。所述菌株具有组氨酸甲酯抗性，抗性浓度为3mg/mL。 所述菌株具D-组氨酸抗性，抗性浓度为3mg/mL。所述菌株的应用方法，将菌株接入发酵培养基，所述发酵培养基由葡萄糖，(NH4)2SO4,玉米浆，KH2PO4, MgSO4O. 5-1. 5 和 CaC0320-40 组成。具体而言，经过优化摇瓶发酵培养基为(g/L):葡萄糖130-160，(NH4)2SO4 20-40,玉米浆 15-25，KH2PO41. 0-1. 5，MgSO4 0. 5-1. 5，CaCO3 20-40。发酵罐上使用的发酵培养基为(g/L):葡萄糖110-130，玉米浆7. 0-10. 0，硫酸铵20-40，磷酸二氢钾1. 0-2. 0，硫酸镁0. 5-1. 5，碳酸钙10. 0-20. 0，生物素30 y g/L，柠檬酸钠 2，VB1 4mg/L，葡萄糖酸钙 5-20, pH 调至 7. O。本发明提供得生产L-组氨酸的菌株,是以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC 31026为出发菌株，经过硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)和紫外(UV)逐级诱变，在斜面基本培养基中添加L-组氨酸结构类似物3-氨基-1，2，4-三氮唑、6-巯基嘌呤、组氨酸甲酯、2-硫尿嘧啶和D-组氨酸，经培养筛选和复筛得到。出发菌株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC31026。发酵法生产L-组氨酸所用培养基组分为种子培养基(g/L):葡萄糖25，玉米浆 20，尿素1. 25，KH2PO4 1.0，MgSO4 0.5，pH 调至1. 0-7. 2 ；发酵培养基为(g/L):葡萄糖130-160，(NH4)2SO4 20-40，玉米浆 15-25，KH2PO41.0-1. 5,MgSO4 0. 5-1. 5，CaCO3 20-40(分消)，pH调至7. O。将菌株以10%的接种量转接到发酵培养基，旋转式摇床转速为200-250r/min，pH 6. 8-7. 0，培养温度30°C，培养时间72h。3L罐上流加发酵基础培养基(g/L):葡萄糖110-130，玉米浆7. 0-10.0，硫酸铵20-40，磷酸二氢钾1. 0-2. 0，硫酸镁0. 5-1. 5，碳酸钙10. 0-20. 0，生物素30 y g/L，柠檬酸钠2，VB1 4mg/L，葡萄糖酸钙 5-20, pH 调至 7. O。发酵罐上工艺为通气量为lvvm, 0 15h控制搅拌转速为700r/min, 15h后控制搅拌转速为600r/min，并进行适当补料，L-组氨酸在发酵液中积累。本发明的有益效果从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) ATCC 31026选育的L-组氨酸结构类似物抗性突变株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZJZGzs(AMre-MP1rHE1^-TUlrDff)，解除了 L-组氨酸的反馈抑制，因此表现出积累高水平L-组氨酸的能力。用该菌已通过摇瓶水平和3L发酵罐水平的发酵法生产L-组氨酸的实验，L-组氨酸产量分别达到9. 7g/L、18. lg/L，为工业化奠定了基础。
图1L-组氨酸选育谱系图生物材料样品保藏一株生产L-组氨酸的菌株，于2012年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2012144，其分类学命名为粘质沙雷氏菌ZJZ G25 SerratiamarcescensZJZ G25,地址中国武汉，武汉大学。
具体实施例方式实施例1出发菌株初始产量的测定将出发菌株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) ATCC 31026划线活化,制备种子培养基，并转接发酵培养基，测得初始产量为2. lg/L。实施例2制备对3-氨基-1，2，4-三氮唑有抗性的突变株将出发菌株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC 31026用浓度2%的硫酸二乙酯在301下诱变处理20111111，涂布到3-氨基-1，2，4-三氮唑(2mg/mL)抗性平板上，30°C培养36h，挑取在此培养基上长出的菌株，作为对3-氨基-1，2，4-三氮唑有抗性的突变株。然后进行L-组氨酸发酵试验，在这些突变株中，L-组氨酸产量最高的突变株称为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)A 07, L-组氨酸产量为 3. 5g/ L。实施例3制备对6-巯基嘌呤有抗性的突变株将实施例2获得的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) A 07用250 U g/mL的亚硝基胍在30°C下诱变处理20min，涂布到6-巯基嘌呤(3mg/mL)抗性平板上，30°C培养36h，挑取在此培养基上长出的菌株，作为对6-巯基嘌呤有抗性的突变株。然后进行L-组氨酸发酵试验，在这些突变株中，L-组氨酸产量最高的突变株称为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)M 20, L-组氛酸产量为 4. 6g/L。实施例4制备对组氨酸甲酯有抗性的突变株将实施例3获得的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)M 20在15W紫外灯下30cm处紫外照射诱变处理40s，涂布到组氨酸甲酯(3mg/mL)抗性平板上，30°C培养36h，挑取在此培养基上长出的菌株，作为对组氨酸甲酯有抗性的突变株。然后进行L-组氨酸发酵试验，在这些突变株中，L-组氨酸产量最高的突变株称为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens) H 35, L-组氨酸产量为 5. 2g/L。实施例5制备对2-硫尿嘧啶有抗性的突变株将实施例4获得的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)H 35先后经过紫外(15W, 30cm, 40s)和硫酸二乙酯(2%，20min，30°C )诱变处理，涂布到2-硫尿嘧啶(2mg/mL)抗性平板上，30°C培养36h，挑取在此培养基上长出的菌株，作为对2-硫尿嘧啶有抗性的突变株。然后进行L-组氨酸发酵试验，在这些突变株中，L-组氨酸产量最高的突变株称为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)T 17, L-组氨酸产量为6. 9g/L。实施例6制备对D-组氨酸有抗性的突变株将实施例5获得的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)T 17先后经过紫外(15W, 30cm, 40s)和亚硝基胍(250 y g/mL，20min，30°C )诱变处理，涂布到D-组氨酸(3mg/mL)抗性平板上，30°C培养36h，挑取在此培养基上长出的菌株，作为对D-组氨酸有抗性的突变株。然后进行L-组氨酸发酵试验，在这些突变株中，L-组氨酸产量最高的突变株称为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)ZJZ G25, L-组氨酸产量为7. 6g/L。实施例7以ZJZ 625发酵法生产L-组氨酸从新鲜斜面上接种一环ZJZ G25菌种到种子培养基(50mL/500mL三角瓶)，30°C，200r/min，培养18h，以10% -15%接种量接入发酵培养基。种子培养基和发酵培养基的成分如本说明书所述。摇瓶培养250mL三角瓶装液量为15mL，30°C，200r/min,培养72h，L-组氨酸产量为 7. 6g/L。实施例8以ZJZ G25在3L发酵罐上分批发酵合成L-组氨酸斜面种子培养和发酵接种条件同实施例7，3L发酵罐中培养基体积为1.8L，通气量为lvvm，接种量10%，培养温度31 土 TC，采用双阶段供氧控制模式，即前IOh转速为700r/min, IOh 后为 600r/min。发酵 56h，L-组氨酸产量为 14. lg/L。实施例9以ZJZ G25在3L发酵罐上补料分批发酵合成L-组氨酸在实施例8双阶段供氧控制基础上，当葡萄糖浓度下降到20g/L时，开始补料。采取的补料策略是每次补10g/L，补料后四小时残糖量基本与补料前相同，葡萄糖消耗至20g/L，再进行补料，共补料四次。发酵60h，L-组氨酸产量为18. lg/L。补料液为500g/L的·葡萄糖。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种L-组氨酸生产菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO M2012144。
2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株具有3-氨基-1，2，4-三氮唑抗性，抗性浓度为2mg/mL。
3.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株具有6-巯基嘌呤抗性，抗性浓度为3mg/mL。
4.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株具有组氨酸甲酯抗性，抗性浓度为3mg/mL。
5.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株具D-组氨酸抗性，抗性浓度为3mg/mL。
6.权利要求1所述菌株在L-组氨酸发酵生产中应用。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，将权利要求1所述菌株接入发酵培养基，所述发酵培养基由葡萄糖，(NH4)2SO4,玉米浆，KH2PO4, MgSO4O. 5-1. 5和CaC0320_40组成。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述发酵培养基还含有生物素，柠檬酸钠，VB1和葡萄糖酸钙。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，发酵前IOh转速为700r/min，IOh后为600r/min。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，发酵液中葡萄糖浓度下降到20g/L时开始补料。
全文摘要
一种L-组氨酸高产菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供一种粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZJZ G25，是以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC 31026为出发菌株，经过硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)和紫外(UV)逐级诱变，通过在基本培养基中添加3-氨基-1,2,4-三氮唑、6-巯基嘌呤、组氨酸甲酯、2-硫尿嘧啶、D-组氨酸等L-组氨酸的结构类似物筛选得到。用所述菌株发酵法生产L-组氨酸，与出发菌株相比，表现出积累高水平L-组氨酸的能力。ZJZ 625摇瓶培养72h，L-组氨酸产量可以达到9.7g/L。3L发酵罐发酵60h，L-组氨酸产量可以达到18.1g/L。
文档编号C12R1/43GK103013876SQ20121053959
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者陈坚, 李江华, 侯颖, 堵国成 申请人:江南大学