专利名称：用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及复合发酵菌剂及其制备方法，尤其是涉及一种用于处理畜禽废物的微生物复合发酵菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
畜禽废物是指畜禽养殖过程中产生的大量养殖废物，因其不断增长的排放量成为环境污染的三大源头之一。畜禽废物主要包括畜禽粪便、尿液、饲料残渣以及冲刷圈舍的污水。畜禽废物除了会污染土壤、水体以外，还会产生大量的臭味气体如氨气、硫化氢、硫醇和甲硫醇等，给环境和人畜的正常生活带来不利的影响。目前国内大中型养殖场普遍采用达标排放、种养平衡、沼气生态的模式来处理畜禽废物，但是这些方法对资金要求、技术要求较高；很多小型猪场沿用传统废物直接用作农业填肥的方法，废物利用率低且易污染环境。近年来，由日本引进的发酵床养殖因其操作简便、资金投入少、处理效果好而得 到了广泛关注，但是发酵床养殖过程中使用的菌剂，一般都是采用针对性不强的单菌剂，对畜禽废物的降解效率低，其对畜禽废物的处理效果不是很显著，影响发酵床养殖技术在大范围推广，因此急需一种高效、针对性强的发酵床复合菌剂来解决上述技术难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够利用畜禽养殖发酵床技术不断繁殖益生菌菌剂并能除臭、抑制畜禽废物中病原微生物生长，同时提高畜禽废物中蛋白质含量的高效、针对性强的用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂及其制备方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂，所述的复合发酵菌剂的活性组分为芽孢杆菌{Bacillus beringensis')保藏号为CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌{Rhodobacter sulfidophilus)保藏号为 CGMCC N0.6613 和纤维单胞菌(CfeBWoffioaas 577.)保藏号为CGMCC N0.6612,所述的芽孢杆菌、所述的嗜硫红细菌和所述的纤维单胞菌的菌种按质量比0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5的比例混合。一种制备微生物复合发酵菌剂的方法，包括以下步骤:
(1)斜面菌种培养
将芽抱杆菌{Bacillus beringensis^)保藏号为CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌{Rhodobacter sulfi dophi lus)保藏号为 CGMCC N0.6613 和纤维单胞菌sp.)保藏号为CGMCC N0.6612分别接于相应的斜面培养基上，在pH为5.8-7.2，温度为28-37 °C的条件下静置培养33-96小时，放入4°C冰箱保存；
(2)液体种子扩大培养
分别挑取2至3环斜面菌种培养后得到的芽孢杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌于相应的液体培养基中，在26-30°C的条件下摇床培养24-48小时，进行液体种子扩大培养，得到芽孢杆菌菌液、嗜硫红细菌菌液、纤维单胞菌菌液；(3)固体种子扩大培养
将芽孢杆菌菌液、嗜硫红细菌菌液、纤维单胞菌菌液按质量比为0.5-1.5:0.5-1.5:
0.5-1.5的比例混合均匀，制成复合菌液，将所述的复合菌液按质量体积百分比4-5%的接种量将其接入到固体扩大培养基中，在温度为28-37°C的条件下，培养时间33-96小时，SP得到复合发酵菌剂。步骤(I)中芽孢杆菌的斜面培养基的配制方法为:将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15-20g依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL，用NaOH调节pH至7.2,0.1MPa 灭菌 15_20min 即可。 步骤(I)中嗜硫红细菌的斜面培养基的配制方法为:将乙酸钠3.0g，氯化铵1.0g,NaCll.0g, K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，MgSO40.5g，CaCl20.05g，酵母膏 2.0g，琼脂 15_20g 依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节pH至6.8,0.07MPa灭菌20min即可。步骤(I)中纤维单胞菌的斜面培养基的配制方法为:将可溶性淀粉20g，KNO3 lg,K2HPO4 0.5g, MgSO4.7H20 0.5g, NaCl 0.5g，FeSO4.7H20 0.0lg，琼脂 15_20g 依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节pH至7.4-7.6,0.1MPa灭菌15_20min即可。步骤(2)中芽孢杆菌的液体培养基的配制方法为:称取IOg玉米淀粉和5g黄豆粉，加入IOOOmL蒸馏水煮沸20min，纱布过滤后，取滤液补加蒸馏水至IOOOmL,调节pH至7.2,0.1MPa 灭菌 15_20min 即可。步骤(2)中嗜硫红细菌的液体培养基的配制方法为:将如下成分乙酸钠3.0g，氯化铵1.0g, NaCll.0g, K2HPO40.5g，KH2PO40.5g, MgSO40.5g，CaCl20.05g，酵母膏 2.0g，依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节pH至6.8,0.07MPa灭菌20min即可。步骤(2)中纤维单胞菌的液体培养基的配制方法为:称取IOg玉米淀粉和5g黄豆粉，加入IOOOmL蒸馏水煮沸20min，纱布过滤后，取滤液补加蒸馏水至IOOOmL,调节pH至7.2-7.4,0.1MPa 灭菌 15_20min 即可。步骤(3)中固体扩大培养基的配制方法为:以麦麸为基准，按质量百分比添加10-15%的玉米粉，加水搅拌均匀，得到水分含量为50-60%的固体扩大培养基。所述的微生物复合发酵菌剂按质量百分比5%_6%的接种量添加于生猪养殖发酵床中用于微生物发酵。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明一种微生物复合发酵菌剂及其制备方法和应用，该复合发酵菌剂的活性组分为芽孢杆菌{Bacillus嗜硫红细菌{Rhodobacter sulfi dophi lus)和纤维单胞菌sp.)，芽抱杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌按质量比0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5的比例混合均匀得到复合发酵菌剂，该复合发酵菌剂对养猪用发酵床具有较好的发酵效果。其中芽孢杆菌产淀粉酶和纤维素酶效果良好，能分解垫料中的淀粉和纤维素，并能产生可供猪拱食的单细胞蛋白；纤维单胞菌能够有效地抑制粪便中大量存在的大肠杆菌等有害菌群，其菌丝高密度繁殖产生的空隙可以提高发酵垫料底层的含氧量，抑制腐生细菌的生长、使底层垫料不易腐败，为芽孢杆菌和嗜硫红细菌繁殖创造更适宜的条件；嗜硫红细菌能够明显分解粪便中的臭粪素、氨气、硫化氢、硫醇和甲硫醇等臭味物质，改良养殖环境，其菌体本身蛋白和矿物质含量较高，也可作为生猪饲料。因此该复合菌剂能抑制发酵床中的有害菌群，发展有益菌群形成良好地有益的微生态环境；同时可以改良发酵垫料成分，产生的菌体蛋白也可以作为其辅助饲料，降低养殖成本；除去养殖环境中的臭味物质，提闻动物福利。综上所述，本发明一种用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂及其制备方法，能够利用畜禽养殖发酵床基质不断繁殖并能除臭、抑制畜禽废物中病原微生物生长，同时提高畜禽废物中蛋白质含量，对畜禽废物的处理效率高、针对性强，有利于发酵床养殖技术的大范围推广。芽抱杆菌菌株为 Bnbll 株,保藏号为 CGMCC N0.6611,于2012年09月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。纤维单胞菌(Cfe77w7Offlmas577.),菌株为 CLA_nb33 株,保藏号为 CGMCC N0.6612,于2012年09月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。嗜硫红细菌{Rhodobactersulfi dophi lus),菌株为 PSB_nb22 株,保藏号为 CGMCCN0.6613，于2012年09·月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1
本发明一种用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂，该复合发酵菌剂的活性组分为芽抱杆菌{Bacillus beringensis)保藏号为 CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌{Rhodobactersulfi dophi lus)保藏号为 CGMCC N0.6613 和纤维单胞菌 iCellulomonas sp.)保藏号为CGMCC N0.6612，芽孢杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌的菌种按质量比为0.5-1.5:
0.5-1.5:0.5-1.5的比例混合，其具体制备方法如下:
(1)斜面菌种培养:将芽抱杆菌{Bacillusberingensis')保藏号为CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌(Rhodobacter sulfi dophi lus)保藏号为CGMCC N0.6613和纤维单胞菌(Cellulomonas印.)保藏号为CGMCC N0.6612分别接于相应的斜面培养基上，在pH为
5.8-7.2，温度为28-37 °C的条件下静置培养33-96小时，放入4°C冰箱保存；
(2)液体种子扩大培养分别挑取2至3环斜面菌种培养后得到的芽孢杆菌、嗜硫红假单胞光合菌和纤维单胞放线菌于相应的液体培养基中，在26-30°C的条件下摇床培养24-48小时，进行液体种子扩大培养，得到芽孢杆菌菌液、嗜硫红假单胞光合细菌菌液、纤维单胞放线菌菌液；
(3)固体种子扩大培养将芽孢杆菌菌液、嗜硫红假单胞光合细菌菌液、纤维单胞放线菌菌液按质量比为0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5的比例混合均匀，制成复合菌液，将所述的复合菌液按质量体积百分比4-5%的接种量将其接入到固体扩大培养基中，在温度为28-37°C的条件下，培养时间33-96小时，即得到复合发酵菌剂。在此具体实施例中，步骤(I)中芽孢杆菌的斜面培养基的配制方法为:将胰蛋白胨log、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15-20g依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,用 NaOH 调节 pH 至 7.2,0.1MPa 灭菌 15_20min 即可。步骤(I)中嗜硫红细菌的斜面培养基的配制方法为:将乙酸钠3.0g，氯化铵1.0g,NaCl1.0g, K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，MgSO40.5g，CaCl20.05g，酵母膏 2.0g，琼脂 15_20g 依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节pH至6.8,0.07MPa灭菌20min即可。步骤(I)中纤维单胞菌的斜面培养基的配制方法为:将可溶性淀粉20g，KNO3 lg,K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H20 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4.7H20 0.0lg，琼脂 15_20g 依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节pH至7.4-7.6,0.1MPa灭菌15_20min即可。其中将可溶性淀粉先用少量冷水调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分，调pH至7.3左右，0.1MPa灭菌15_20min备用。在此具体实施例中，步骤(2)中芽孢杆菌的液体培养基的配制方法为:称取10g玉米淀粉和5g黄豆粉,加入1000mL蒸懼水煮沸20min,纱布过滤后,取滤液补加蒸懼水至1000mL,调节 pH 至 7.2,0.1MPa 灭菌 15_20min 即可。步骤(2)中嗜硫红细菌的液体培养基的配制方法为:将如下成分乙酸钠3.0g，氯化铵1.0g, NaCll.0g, K2HPO40.5g，KH2PO40.5g, MgSO40.5g，CaCl20.05g，酵母膏 2.0g，依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节pH至6.8,0.07MPa灭菌20min即可。步骤(2)中纤维单胞菌的液体培养基的配制方法为:称取0g玉米淀粉和5g黄豆粉，加入IOOOmL蒸馏水煮沸20min，纱布过滤后，取滤液补加蒸馏水至IOOOmL,调节pH至7.2-7.4,0.1MPa 灭菌 15_20min 即可。在此具体实施例中，步骤(3)中固体扩大培养基的配制方法为:以麦麸为基准，按质量百分比添加10-15%的玉米粉，加水搅拌均匀，得到水分含量为50-60%的固体扩大培养基。实施例2
本发明一种用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂，该复合发酵菌剂的活性组分为芽抱杆菌{Bacillus beringensis)保藏号为 CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌{Rhodobactersulfi dophi lus)保藏号为 CGMCC N0.6613 和纤维单胞菌577.)保藏号为CGMCC N0.6612，芽孢杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌的菌种按质量比为1:1:1的比例混合，其制备方法同上述实施例1。实施例3
本发明一种用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂，该复合发酵菌剂的活性组分为芽抱杆菌{Bacillus beringensis)保藏号为 CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌{Rhodobactersulfi dophi lus)保藏号为 CGMCC N0.6613 和纤维单胞菌577.)保藏号为CGMCC N0.6612。芽孢杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌的菌种按质量比为0.5:1:0.5的比例混合，其制备方法同上述实施例1。实施例4
本发明一种用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂，该复合发酵菌剂的活性组分为芽抱杆菌{Bacillus beringensis)保藏号为 CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌{Rhodobactersulfi dophi lus)保藏号为 CGMCC N0.6613 和纤维单胞菌(577.)保藏号为CGMCC N0.6612。芽孢杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌的菌种按质量比为1.5:1:1.5的比例混合，其制备方法同上述实施例1。实施例5
该实施例为利用本发明的复合发酵菌剂处理畜禽废物的应用实施例。将本发明微生物复合发酵菌剂加入到畜禽废物和农作物下脚料混合物中，该微生物复合发酵菌剂的质量占混合发酵物质量的5% 6%，初始pH值为5.0，发酵2 6天，得到无臭、蛋白含量高、纤维含量低的发酵床。本方法通过提供合适菌剂实现畜禽废物的资源化高效利用，是一种资源节约、环境友好的创新型技术，具有环境效益与经济效益，实现可持续发展。对比试验
设对照组(天然微生物菌群)、实施例2组、实施例3组和实施例4组，将实施例2、3和4制得的微生物复合发酵菌剂分别加入相对应的实施例1组、实施例2组和实施例3组的畜禽垃圾中，接种量为7公斤；对照组加入等质量生理盐水，四组均于30°C恒温发酵，每2天上下翻动搅拌一次，分别于O天、2天和6天时取样测定结果如表I所示:
表I`
权利要求
1.一种用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂，其特征在于:所述的复合发酵菌剂的活性组分为芽孢杆菌iBacillus beringensis )保藏号为CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌{Rhodobacter sulfidophilus)保藏号为 CGMCC N0.6613 和纤维单胞菌(SP.)保藏号为CGMCC N0.6612，所述的芽孢杆菌、所述的嗜硫红细菌和所述的纤维单胞菌的菌种按质量比0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5的比例混合。
2.一种制备如权利要求1所述的微生物复合发酵菌剂的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)斜面菌种培养 将芽抱杆菌{Bacillus beringensis^)保藏号为CGMCC N0.6611、嗜硫红细菌{Rhodobacter sulfi dophi lus)保藏号为 CGMCC N0.6613 和纤维单胞菌(sp.)保藏号为CGMCC N0.6612分别接于相应的斜面培养基上，在pH为5.8-7.2，温度为28-37 °C的条件下静置培养33-96小时，放入4°C冰箱保存； (2)液体种子扩大培养 分别挑取2至3环斜面菌种培养后得到的芽孢杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌于相应的液体培养基中，在26-30°C的条件下摇床培养24-48小时，进行液体种子扩大培养，得到芽孢杆菌菌液、嗜硫红细菌菌液、纤维单胞菌菌液； (3)固体种子扩大培养 将芽孢杆菌菌液、嗜硫红细菌菌液、纤维单胞菌菌液按质量比为0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5的比例混合均匀，制成复合菌液，将所述的复合菌液按质量体积百分比4-5%的接种量将其接入到固体扩大培养基中，在温度为28-37°C的条件下，培养时间33-96小时，SP得到复合发酵菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于:步骤(I)中芽孢杆菌的斜面培养基的配制方法为:将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15-20g依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,用NaOH调节pH至7.2，0.1MPa灭菌15-20min 即可。
4.根据权利要求2所述的微生物复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于:步骤(I)中嗜硫红细菌的斜面培养基的配制方法为:将乙酸钠3.0g，氯化铵1.0g, NaCl1.0g，K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，MgSO40.5g，CaCl20.05g，酵母膏2.0g，琼脂15_20g依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节pH至6.8,0.07MPa灭菌20min即可。
5.根据权利要求2所述的微生物复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于:步骤(I)中纤维单胞菌的斜面培养基的配制方法为:将可溶性淀粉20g，KNO3 lg, K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H20 0.5g, NaCl 0.5g，FeSO4.7H20 0.01g，琼脂15_20g依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节 pH 至 7.4-7.6,0.1MPa 灭菌 15_20min 即可。
6.根据权利要求2所述的微生物复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于:步骤(2)中芽孢杆菌的液体培养基的配制方法为:称取IOg玉米淀粉和5g黄豆粉，加入IOOOmL蒸馏水煮沸20min,纱布过滤后,取滤液补加蒸懼水至IOOOmL,调节pH至7.2,0.1MPa灭菌15_20min即可。
7.根据权利要求2所述的微生物复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于:步骤(2)中嗜硫红细菌的液体培养基的配制方法为:将如下成分乙酸钠3.0g，氯化铵1.0g, NaCll.0g,K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，MgSO40.5g，CaCl20.05g，酵母膏 2.0g，依次加入适量水中，煮沸，补水至IOOOmL,调节pH至6.8,0.07MPa灭菌20min即可。
8.根据权利要求2所述的微生物复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于:步骤(2)中纤维单胞菌的液体培养基的配制方法为:称取IOg玉米淀粉和5g黄豆粉，加入IOOOmL蒸馏水煮沸20min,纱布过滤后,取滤液补加蒸懼水至IOOOmL,调节pH至7.2-7.4,0.1MPa灭菌15-20min 即可。
9.根据权利要求2所述的微生物复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于:步骤(3)中固体扩大培养基的配制方法为:以麦麸为基准，按质量百分比添加10-15%的玉米粉，加水搅拌均匀，得到水分含量为50-60%的固体扩大培养基。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的微生物复合发酵菌剂的应用，其特征在于:所述的微生物复合发酵菌剂按质量百分比5%-6%的接种量添加于生猪养殖发酵床中用于微生 物发酵。
全文摘要
本发明公开了一种用于处理畜禽废物的复合发酵菌剂及其制备方法，特点是该复合发酵菌剂的活性组分为芽孢杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌按质量比为0.5-1.50.5-1.50.5-1.5的比例混合，制备过程包括将芽孢杆菌、嗜硫红细菌和纤维单胞菌进行斜面菌种培养的步骤；然后进行液体种子扩大培养得到芽孢杆菌菌液、嗜硫红细菌菌液和纤维单胞菌菌液的步骤；将上述菌液按质量比0.5-1.50.5-1.50.5-1.5混合后，按4-5％(w/v)的接种量将其接入到固体扩大培养基中扩大培养得到复合发酵菌剂，优点是能够除臭、抑制畜禽废物中病原微生物生长，同时提高畜禽废物中蛋白质含量，处理效率高、针对性强。
文档编号C12R1/07GK103074228SQ201210542259
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者吴祖芳, 翁佩芳, 毕泗伟, 钟仁方 申请人:宁波大学