Tnf基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种TNF基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对G8226A位点的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，针对G-308A位点的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18，针对A1031G位点的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20，针对G863T位点的SEQ?ID?NO.21及SEQ?ID?NO.22，针对G857A位点的SEQ?ID?NO.23及SEQ?ID?NO.24，针对G8146C位点的SEQ?ID?NO.25及SEQ?ID?NO.26，和/或针对C5478T位点的SEQ?ID?NO.27及SEQ?ID?NO.28；有不同anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
【专利说明】TNF基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种TNF基因突变检测特异性引物和液相芯片。
【背景技术】
[0002]肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)位于6号染色体6ρ21.3短臂上，是肿瘤坏死因子超家族成员之一。肿瘤坏死因子是以巨噬细胞为主产生的一种细胞因子，它的最明显的活性特征是可以在体内或体外特异性地杀伤肿瘤细胞，对正常组织细胞则无明显毒性作用。淋巴细胞产生的淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)在DNA及氨基酸序列上与肿瘤坏死因子同源性较高，尤其是功能上非常相似，因此又将巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子命名为肿瘤坏死因子α (TNF-α)，将淋巴细胞产生的淋巴毒素命名为肿瘤坏死因子β (TNFP)t5TNF作为一种细胞因子，不仅具有对瘤细胞的细胞毒杀伤作用，同时也参与抗病毒、抗感染、凝血、发热、休克、多器官功能衰竭、恶液质等多种病理生理过程，TNF还可激活巨噬细胞及多形核粒细胞、增强其吞噬功能，促进组织相容性抗原的表达、促分化诱导以及调节机体的免疫应答等多种重要的生物功能，是一种具有潜在前途的抗肿瘤、抗病毒感染以及免疫调节生物制剂。另外TNF与多种疾病的发生存在相关性，例如，TNF与胃癌、慢性支气管炎、全结肠炎、克罗恩病、强迫性精神障碍、糖尿病和消化道癌等疾病有关。
[0003]目前，TNF基因突变检测方法主要有:PCR-RFLP技术、荧光定量PCR技术和SNaPshot技术。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。。荧光定量PCR技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。SNaPShot技术检测效率高，但存在仪器昂贵、样品分析均价高、对样品要求高、重复性差等缺点 ，而且众多疾病与易感基因关系的研究仍需常规实验室中小规模研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供TNF基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测 TNF 基因七种常见基因型 G8226A、G-308A、A1031G、G863T、G857A、G8146C 和 C5478T的野生型和突变型。
[0005]一种TNF基因突变检测液相芯片，包括有:
[0006](A).针对TNF基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对G8226A位点的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16，针对G-308A位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对 A1031G 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，针对 G863T 位点的 SEQ IDN0.21 及 SEQ ID N0.22，针对 G857A 位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQID N0.24，针对 G8146C 位点的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26，和 / 或针对 C5478T 位点的SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.14 ；
[0007](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.29~SEQ IDN0.42,且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0008]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0009]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对G8226A、G-308A位点的SEQ IDN0.43 及 SEQ ID N0.44，针对 A1031G、G863T、G857A位点的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46，针对G8146C位点的SEQ ID N0.47及SEQ ID N0.48，和/或针对C5478T位点的SEQ IDN0.49 及 SEQ IDN0.50。
[0010]在其中一个实施例中，所述ASPE弓丨物为:针对G8226A位点的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.15组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.16组成的序列，针对G-308A位点的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.18组成的序列，针对A1031G位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.20组成的序列，针对G863T位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.21组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.22组成的序列，针对G857A位点的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.23组成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.24组成的序列，针对G8146C位点的由 SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.25 组成的序列及由 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.26 组成的序列，和/或针对C5478T位点的由SEQ IDN0.13和SEQ ID N0.27组成的序列及由SEQID N0.14和SEQ ID N0.28组成的序列。
[0011]本发明的另一目的是提供用于TNF基因突变检测的特异性引物。
[0012]具体技术方案如下。用于TNF基因突变检测的特异性引物，特异性引物为针对G8226A 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 G-308A 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQID N0.18，针对 A1031G 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，针对 G863T 位点的 SEQ IDN0.21 及 SEQ ID N0.22，针对 G857A 位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24，针对 G8146C位点的 SEQ ID N0.25 及 SEQ IDN0.26，和 / 或针对 C5478T 位点的 SEQID N0.27 及 SEQ IDN0.28。
[0013]本发明的主要优点在于:
[0014]1.本发明所提供的TNF基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的TNF基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0015]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点， 准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。[0016]3.本发明的检测方法步骤简单，7种突变位点检测可通过一步PCR即可完成4条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0017]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【具体实施方式】
[0018]实施例1TNF基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0019]一、ASPE 引物
[0020]针对TNF 基因七种常见基因型 G8226A、G-308A、A1031G、G863T、G857A、G8146C 和C5478T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0021 ] 表1TNF基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
[0022]
【权利要求】
1.一种TNF基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有: (A).针对TNF基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对G8226A位点的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16，针对G-308A位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对 A1031G 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，针对G863T位点的 SEQ IDN0.21 及 SEQ ID N0.22，针对G857A位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ IDN0.24，针对 G8146C 位点的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26，和 / 或针对 C5478T 位点的 SEQID N0.27 及 SEQ ID N0.28 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.14 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.29~SEQ ID N0.42，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的TNF基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对G8226A、G-308A 位点的 SEQ ID N0.43 及 SEQ ID N0.44，针对 A1031G、G863T、G857A 位点的SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46，针对 G8146C 位点的 SEQ ID N0.47 及 SEQ ID N0.48，和 /或针对 C5478T 位点的 SEQ ID N0.49 及 SEQ ID N0.50。
3.根据权利要求1或2所述的TNF基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为:针对G8226A位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.16组成的序列，针对G-308A位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.18组成的序列，针对A1031G位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.6`和SEQ ID N0.20组成的序列，针对G863T位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.21组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.22组成的序列，针对G857A位点的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.23组成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.24组成的序列，针对G8146C位点的由SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.25组成的序列及由SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.26组成的序列，和/或针对C5478T位点的由SEQID N0.13和SEQ ID N0.27组成的序列及由SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.28组成的序列。
4.根据权利要求1或2所述的TNF基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5— 10 个 T。
5.用于TNF基因突变检测的特异性引物，其特征是，特异性引物为针对G8226A位点的SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 G-308A 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对A1031G 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，针对 G863T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQID N0.22，针对 G857A 位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24，针对 G8146C 位点的 SEQ IDN0.25 及 SEQ IDN0.26，和 / 或针对 C5478T 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28。
【文档编号】C12N15/11GK103865989SQ201210545880
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2012年12月14日
【发明者】刘丽, 许昌有 申请人:益善生物技术股份有限公司