专利名称：在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽nz2114的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法。
背景技术：
抗菌肽(AMP)是生物体内具有生物活性的小分子多肽，主要特点如下抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，而且对真菌，原虫乃至病毒和肿瘤细胞都有杀伤或抑制作用(Brandenburg, Merres et al. 2012)。由于其突出的生物学特性,最有潜力作为型新安全无害抗生素替代品，从而备受科学界关注(Eckert 2011; Brandenburg, Merres等,2012)。Plectasin是2005年由Mygid等人从来源于北欧松林地表腐生子囊菌(Pseudoplectania nigrella)中分离得到一种具有抗菌功能的抗菌肽,也是首例真菌防御素。Plectasin基因开放阅读框编码一个95个残基长的前体肽，由一个信号肽序列(残基1-23)，一个前片断(残基23-55)和一个40个残基的C端区域的成熟多肽(残基56-95)，与几种无脊椎动物防御素存在50-55%序列相似性。Plectasin成熟多肽由40个AA组成，含有6个Cys残基和5个Iys残基，一个区别的四肽(DEDD)模式，分子量为4，398. 80Da，净电荷在+ I到+ 3之间变化，主要取决于它的两个组氨酸的离子状态。其6个Cys在分子内形成3对二硫键(Cys4_Cys30，Cysl5-Cys37, Cysl9_Cys39)，二级结构由三对二硫键稳定的一个N端的a-螺旋和C端的两个反向平行的￠-折叠结构以及螺旋和折叠结构之间的Loop 区组成(Mygind, Fischer 等，2005)。NZ2114是新型的抗菌肽,属`于真菌防御素Plectasin的突变体。D. Ravent6s等(2005)基于提高该真菌防御素对耐药金黄色葡萄球菌的抗菌活性，通过高通量突变筛选到一个对金黄色葡萄球菌具有强烈抑菌活性的突变体(Raventos，Taboureau等，2005)。Brinch(2010)等对NZ2114胞内和胞外杀菌活性做了综合研究，结果显示，NZ2114对MRSA、VRSA、MSSA具有较强的胞内和胞外杀菌活性，与达托霉素相当，而胞内杀菌活性甚至优于万古霉素(Brinch, Tulkens等,2010)。D. Andes等(2009)对14株金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA和耐青霉素的肺炎链球菌FRSP)，结果显示NZ2114的MIC相对于本体防御素增加30倍之多(0. 06 u g/ml 2. 0 u g/ml) (Andes, Craig等，2009)，进而通过小鼠感染模型对其药物动力学进行相关研究，结果显示，皮下注射30min后小鼠血液中NZ2114浓度达到峰值，其药物半衰期为0. 38到1. 0h，同时对NZ2114的蛋白结合率进行了检测，结果表明NZ2114蛋白结合率为80%(Andes，Craig等，2009)。
D.Andes等(2009)还对NZ2114抗生素后效应(PAE)参数进行研究，其对感染肺炎链球菌(S. pneumoniae strain ATCC 10813, MIC, 0. 06mg/ml))小鼠注射单剂量为 10、40 和 60mg/kg 后其 PAE 分别为 2. 3,4. 5,7. 7h,而 NZ2114 对金黄色葡萄球菌(S. aureus strain ATCC25923，MIC,1. 0mg/ml)的PAE分别为1. 2、2. 6、4. 6h。而且相关研究表明，NZ2114以高于MIC单剂量处理的金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌在12 15h内停止用药，病原菌不会出现反弹。金黄色葡萄球菌是世界范围内流行的易感病原菌，容易引起人败血症，表皮及软组织感染，肺炎等疾病(Diekema, Pfaller等,2001)。随着人类抗生素大量频繁使用，加上金黄色葡萄球菌自身易获得耐药性，大量MRSA菌株不断在临床或社区发现，以致形成了两大类型医院获得型 MRSA (HA-MRSA)和社区感染型 MRSA (CA-MRSA) (Rountree and Freeman1955;Chambers and DeLeo 2009;Elston, Meigh 等，2009;Skov and Jensen 2009;Eckert2011)，对人类健康造成巨大威胁。研究开发新型杀灭金黄色葡萄球菌的抗生素替代品对于预防和治疗由金黄色葡萄球菌，特别是MRSA引起中疾病具有重要意义。抗菌肽替代传统抗生素应用于由细菌感染所引起的各种疾病一直备受科学界关注，也是人类对抗各种病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌谱过宽，稳定性不好，具有细胞毒性，抗菌活性不足，用药多样性，生产成本高(基因克隆表达产量太低和化学合成成本过高)等一直是抗菌肽应用中面临的挑战(Eckert 2011)。抗菌肽NZ2114具有抗菌谱窄，不具有细胞毒性，抗菌活性强等优点。目前，关于抗菌肽NZ2114相关研究中使用的NZ2114均为化学合成(Andes, Craig 等，2009; Brinch, Tulkens 等，2010; Xiong, Hady 等，2011),且未见有关其基因克隆表达方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法。为了实现本发明目的，本发明的一种含有编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，包括诱导型启动子、位 于启动子下游的编码a-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。已知抗菌肽NZ2114 (菌丝霉素衍生物)的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。前述的表达载体，其中所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列是按照酵母所偏爱的密码子进行优化的序列，具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。前述的表达载体，出发载体优选为pPICZ a A。前述的表达载体，在编码a -因子分泌信号肽的核苷酸序列的5’端连接有XhoI酶切位点，且在XhoI酶切位点的5’端连接有保护碱基CCG ;在编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端连接有XhaI酶切位点，且在XhaI酶切位点的3’端连接有保护碱基GC。本发明还提供含有上述表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞优选为毕赤酵母，更优选为毕赤酵母X-33基因工程菌。本发明还提供一种重组巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X_33/NZ2114,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年12月13日，保藏号CGMCC No. 6987。本发明还提供培养上述毕赤酵母X-33基因工程菌的方法，包括以下步骤I)种子液的制备从YPD平板挑取酵母转化子单菌落，接种于含IOOii g/mlzeocin的IOml YH)液体培养基中，29 °C，250rmp，摇床培养18_24h，以1%接种量接种于200ml YPD液体培养基中，29°C，250rmp，摇床培养16_18h，至OD6tltol值为6，即得种子液；2)发酵培养25°C 29°C下，按10%的接种量将上述种子液加入2L基础盐培养基中，调pH值至5. 0，加入9. 6ml PMTl，通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；
3)饲喂碳源观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加含12%。PMTl的50%葡萄糖溶液，流加速度为12 24ml/L/min，连续流加6 8h，转速上调至IOOOrpm ；4)甲醇诱导流加葡萄糖后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速lml/L/min逐渐增加到第六小时的6ml/L/min,转速上调至IIOOrpm, pH上调至5. 5,控制溶氧在20%以上，至发酵结束；其中，步骤2)中使用的基础盐培养基配方为45g葡萄糖、50gNH4H2P04、20g K2SO4,15g MgSO4 7H20、6g KH2P04、0. 4g CaSO4 和1. 5g KOH，加水定容至 IL0本发明还提供上述毕赤酵母X-33基因工程菌分泌的重组蛋白的纯化方法，其包括对发酵液进行透析脱盐、冷冻干燥、复溶和离子交换层析等步骤。本发明进一步提供一种在重组毕赤酵母中表达抗菌肽NZ2114的方法，其是利用上述表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽NZ2114。本发明通过优化抗菌肽NZ2114基因序列，构建特异表达载体，首次实现了抗菌肽NZ2114在毕赤酵母中的高效表达，产量突破克级水平，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题，并建立完善的纯化体系，可实现规模化生产，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。
图1为本发明实施例1中PCR法扩增NZ2114基因的产物琼脂糖凝胶电泳检测结果;其中，M :标准DNA markerll，上样量为5iil ；1 :以pFl、pRl为引物，PUC57-NZ2114为模板的PCR扩增产物，上样量 为2 Ul。图2为本发明实施例2中大肠杆菌DH5 a阳性转化子鉴定结果；其中，1_8 :1_8号转化子(PFUpRl)特异性引物PCR产物，点样量为5iil ；9-16 :1_8号转化子的AOX通用引物PCR产物，点样量5u I ；M :标准DNA MarkerII。图3为本发明实施例3中重组pPICZaA_NZ2114载体线性化电泳结果；其中，MTrans5K DNA marker,点样量为5u I ；1 :线性化的重组载体pPICZ a A-NZ2114，点样量为5u I ；2 :没有被线性化的重组载体口？102 0 4-似2114，上样量为5111。图4为本发明实施例3中重组酵母菌株X-33的鉴定结果；其中，M :50bp DNAmarker,上图1_15 :1_15号重组酵母转化子；下图1_15 16-30号重组酵母转化子。图5为本发明实施例4中N7、N10、N13重组酵母菌株摇瓶水平发酵上清抑菌试验结果；其中，Amp :点样量为IOiU的1000X氨苄青霉素；空载体PPICZaA空质粒重组转化子120h发酵液上清；X-33 :毕赤酵母X-33原始菌株120h发酵液上清；N7、N10、N13 :表示编号为7、10、13号的NZ2114重组酵母转化子。图6为本发明实施例4中N7、N10, N13重组酵母菌株120h诱导摇瓶水平发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，1、2、3分别为N7、N10, N13转化子120h摇瓶水平诱导发酵液上清IOy I上样量;M为超低分子量蛋白Marker。图7为本发明实施例4中N13重组酵母菌株诱导发酵120h后发酵上清抑菌活性检测结果；其中，Amp :点样量为IOiU的1000X氨苄青霉素；空载体PPICZaA空质粒重组转化子120h发酵液上清；X-33 :毕赤酵母X-33原始菌株120h发酵液上清；1_3 :N13转化子摇瓶水平三个平行样120h发酵上清，上样量为50 yl。图8为本发明实施例4中N13重组酵母菌株摇瓶水平29°C不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M :超低分子量蛋白marker ；1 :pPICZ a A空质粒重组转化子120h发酵液上清IOiU ;2 :毕赤酵母X-33原始菌株120h发酵液上清IOyl ;3_8 N13重组酵母菌株诱导表达0h、24h、48h、72h、96h、120h发酵上清10 yl。图9为本发明实施例5中N13重组酵母菌株29°C高密度发酵不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测及抗菌活性检测结果；其中，A为Tricine-SDS-PAGE检测29°C诱导不同诱导时间重组酵母菌株蛋白表达情况。M :超低分子量蛋白marker ;1_6 :分别表示诱导011、2411、4811、7211、9611、12011发酵上清液，上样量为5111 ;B为29°C诱导下不同诱导时间点发酵液上清对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抗菌活性检测。Amp 10u I ； 1000 X氨苄青霉素；1_11 :分别表示诱导 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h 发酵上清，上样量为25iil。图10为本发明实施例5中29°C诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中总蛋白浓度和菌体湿重随时间变化曲线。图11为本发明实施例5中29°C诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中抗菌肽NZ2114浓度和菌体湿重随时间变化曲线图12为本发明实施例5中N13重组酵母菌株25°C高密度发酵不同诱导时间发酵上清Tricine-SDS-PAGE电泳检测及抗菌活性检测结果；其中，A为Tricine-SDS-PAGE检测25°C诱导不同诱导时间重组酵母菌株蛋白表达情况。M :超低分子量蛋白marker ;1_6 :分别表示诱导011、2411、4811、7211、9611、12011发酵上清液，上样量为5111 ;B为25°C诱导不同诱导时间点发酵液上清对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抗菌活性检测。Amp 10u I ； 1000 X氨苄青霉素；1-11 :分别表 示诱导 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h 发酵上清，上样量为25u I0图13为本发明实施例5中25°C诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中总蛋白浓度和菌体湿重随时间变化曲线。图14为本发明实施例5中25°C诱导重组酵母菌株N13高密度发酵过程中抗菌肽NZ2114浓度和菌体湿重随时间变化曲线。图15为本发明实施例6中抗菌肽NZ2114纯化及鉴定结果；其中，M :超低分子量蛋白marker ；A为发酵液纯化前后的Tricine-SDS-PAGE电泳检测，1:发酵液；2 :纯化后rNZ2114，上样量为IOiU出为发酵液质谱图；C为纯化后的rNZ2214质谱图。图16为本发明实施例8中抗菌肽NZ2114溶血性实验结果。图17为本发明实施例9中抗菌肽NZ2114理化性质分析结果；其中，A为温度对抗菌肽NZ2114活性的影响。1-5 :分别为4°C、40°C、60°C、80°C、100°C处理Ih抗菌肽NZ2114溶液；I' -5' 分别经过4°C、40°C、60 V >80°C UOO V处理Ih的PBS缓冲液。B为pH对抗菌肽NZ2114活性的影响。1-5 :分别表示抗菌肽NZ2114在pH为2、4、6、8、10的缓冲液中，37°C孵育12h后的抗菌活性；1'-5' :分别不含抗菌肽NZ2114的pH为2、4、6、8、10的缓冲液，37°C孵育12h后的抗菌活性。图18为本发明实施例10中抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线；其中，A :甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(MSSA)ATCC25923 ；B :耐甲氧西林型金黄色葡萄球菌(MRSA) ATCC43300。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989)。以下实施例中使用的酶和试剂限制性内切酶、PfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Biolabs、Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品。其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。以下实施例中涉及的培养基配方LB培养基胰蛋白胨10g/l，酵母浸提取物5g/l，NaCl 10g/l ;固体LB培养基则加A 2%的琼脂糖。 低盐LB培养基胰蛋白胨10g/l，酵母浸提取物5g/l，NaCl 5g/l ;固体低盐LB培养基则加入2%的琼脂粉。MH培养基酪蛋白水解物17. 5g/l，牛肉浸粉5g/l，淀粉1. 5g/l ;固体MH培养基则加入2%的琼脂粉。YH)培养基蛋白胨20g/l，酵母浸提取物10g/l，葡萄糖20g/l ;固体YTO培养基则加入2%琼脂粉。YPDS培养基蛋白胨20g/l，酵母浸提取物10g/l，山梨醇182. 2g/l，葡萄糖20g/1，琼脂粉20g/l。BMGY培养基(/L):酵母浸提取物10g，蛋白胨20g，10%甘油100ml，13. 4%无氨基酸酵母氮源(YNB) IOOml,0. 02% 生物素 2ml, lmol/1 磷酸缓冲液，pH6. 0，100ml。BMMY培养基(/L):酵母浸提取物10g，蛋白胨20g，0. 5%甲醇溶液100ml，13. 4%无氨基酸酵母氮源(YNB) IOOml,0. 02%生物素2ml，lmol/1磷酸缓冲液，pH6. 0, IOOml0 有关LB培养基、低盐LB、MH、YPD、YPDS, BMGY, BMMY等培养基的使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。以下实施例中涉及的基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。以下实施例中涉及的蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE，参照ScMgger 2006。以下实施例中涉及的蛋白质浓度测定方法为考马斯亮蓝法。以下实施例中涉及的蛋白分子量的确定方法为MALD1-T0F MS法。以下实施例中涉及的蛋白纯化的方法为基于离子层析法。以下实施例中涉及的发酵方法为高密度发酵法。以下实施例中涉及的菌种和质粒概述于表1:表I供试菌种和质粒
权利要求
1.一种含有编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，其特征在于，包括诱导型启动子、位于启动子下游的编码α -因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码抗菌肽ΝΖ2114的 DNA序列，所述编码抗菌肽ΝΖ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列如 SEQ ID No. 2 所示。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为 pPICZa A0
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，在编码a-因子分泌信号肽的核苷酸序列的5’端连接有XhoI酶切位点，且在XhoI酶切位点的5’端连接有保护碱基CCG ;在编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端连接有XhaI酶切位点，且在XhaI酶切位点的3’端连接有保护碱基GC。
5.含有权利要求1-4任一项所述表达载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其为毕赤酵母。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其为毕赤酵母X-33基因工程菌。
8.权利要求7所述基因工程菌的培养方法，包括以下步骤1)种子液的制备从YPD平板挑取酵母转化子单菌落,接种于含100yg/mlzeocin的 IOml YPD液体培养基中，290C，250rmp，摇床培养18_24h，以1%接种量接种于200ml YPD液体培养基中，29°C，250rmp，摇床培养16_18h，至OD6tltlnm值为6，即得种子液；2)发酵培养25°C 29°C下，按10%的接种量将上述种子液加入2L基础盐培养基中，调 pH值至5. 0，加入9. 6ml PMTl，通气量维持在8vvm，转速为600rpm，溶氧维持在20%以上；3)饲喂碳源观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80%以上，开始流加含UXf5PMTl 的50%葡萄糖溶液，流加速度为12 24ml/L/min，连续流加6 8h，转速上调至IOOOrpm ；4)甲醇诱导流加葡萄糖后，饥饿半小时，开始补加100%甲醇，由第一小时的流速Iml/ L/min逐渐增加到第六小时的6ml/L/min,转速上调至IIOOrpm, pH上调至5. 5,控制溶氧在 20%以上，至发酵结束；其中，步骤2)中使用的基础盐培养基配方为45g葡萄糖、50gNH4H2P04、20g K2S04、15g MgS047H20、6g ΚΗ2Ρ04、0· 4g CaSO4 和1. 5g Κ0Η，加水定容至 IL0
9.一种在重组毕赤酵母中表达抗菌肽NZ2114的方法，其是利用权利要求1-4任一项所述的表达载体转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽NZ2114。
10.重组毕赤酵母菌(Pichiapastoris)X_33/NZ2114，其保藏编号为 CGMCC No. 6987
全文摘要
本发明提供一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法，通过构建含有经过酵母偏爱密码子优化编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，并转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽NZ2114。本发明通过优化抗菌肽NZ2114基因序列，构建特异表达载体，首次实现了抗菌肽NZ2114在毕赤酵母中的高效表达，产量突破克级水平，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题，并建立完善的纯化体系，可实现规模化生产，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。
文档编号C12R1/84GK103045636SQ20121055006
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者王建华, 张勇, 滕达, 王秀敏, 毛若雨 申请人:中国农业科学院饲料研究所