专利名称：可用于检测与精神分裂症相关的drd4基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助诊断精神分裂症的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因甲基化程度的试剂盒及其应用。
背景技术：
精神分裂症(Schizophrenia)是重大的精神疾病之一，精神分裂症可引起思考方式及情绪反应的崩溃，具体表现有感觉、知觉、思维、情感以及意志行为等障碍。精神分裂症是一种遗传因素和环境心理因素共同作用引起的疾病。据了解，中国目前的精神分裂症患者高达780万。全世界，每100人中就有一名精神分裂症患者。当前虽然精神病学研究主要致力于神经科学领域，但至今未找出合理的发病机制。因此，开展可行性的精神分裂症研究具有很大的如景。多巴胺受体D4 (DRD4)分布于中脑边缘区，是由基因编码的一种G蛋白偶联受体，而DRD4基因位于11ρ15.5 (第11号染色体短臂15区5带)。目前国内外的研究已经证明“精神分裂症的临床症状是由于中枢多巴胺活动过强造成的”。而且也有研究背景表明基因的甲基化是在不改变DNA序列情况下，影响基因表达。基因甲基化和精神分裂症之间是否存在相关性有待进一步验证。目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因甲基化程度的试剂盒的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因甲基化程度的试剂盒及其应用，其中DRD4基因甲基化水平与精神分裂症患病率呈负相关，检测效率高，针对性强。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种可用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因甲基化程度的试剂盒，该试剂盒包括一对DRD4基因启动子区甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序弓丨物，其中
所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - GTGAATTTAGGAGGTTGGGGTAGA _3’ ；
所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ -Biotin- CAAAAAAACAAACAACCCCTCTAA -3’ ；
所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID N0.3所示:
5，- TTGGGGTAGAGATTAGT -3'一种可用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因甲基化程度的试剂盒的应用，在外周血检测中，该试剂盒可用于男 性人群精神分裂症的辅助诊断、检测或筛查药物中。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明首次公开了可用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因甲基化程度的试剂盒及其应用，DRD4基因启动子区域的高甲基化水平导致DRD4基因的低表达，从而影响DRD4在脑部通路转运的循环量减少，最后导致精神分裂症的发生和发展。因此DRD4基因甲基化水平与精神分裂症患病率呈负相关，以检测DRD4基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对精神分裂症的检测，检测效率高，针对性强，同时，以DRD4基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为精神分裂症辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
图1为DRD4基因被检测序列所在区域以及所检测的5个CpG点的关联分析结果；(例如CpGl与CpG2的相关系数为0.98，CpG2与CpG3的相关系数为0.95)
图2为甲基化水平检测结果示例:表示甲基化程度，如图示CpGl到CpG5的甲基化程度分别为76%，68%，87%，100%, 98%, 87% ;图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平(即阴影框对应的上方数字)。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例1、研究对象的收集
从某医院收集精神分裂症患者，总共354例，同时收集300名正常者作为对照组，经过年龄(最终选定样本的年龄均在30岁上下)、性别、知识背景以及DNA相关浓度这些数据的分析，筛选出匹配指数(年龄，学历，性别)较高的实验样本量:30名精神分裂症患者(15名男性+15名女性)，30名正常对照组(15名男性+15名女性)。2、基因组DNA的提取
应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门致善生物科技有限公司，500ul体系)提取样本的全血基因组DNA，再通过核酸蛋白测定仪检测所得DNA的浓度，以供DRD4基因启动子区DNA甲基化水平的检测。3、DNA甲基化水平测定
本研究采用重亚硫酸盐焦磷酸测序技术对DRD4基因启动子区的6个CpG位点(如图1)进行了 DNA甲基化水平检测。此技术的基本原理:用试剂盒中的重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计,用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下:
(1)甲基化特异性上游引物(Forwardprimer)
5’ - GTGAATTTAGGAGGTTGGGGTAGA -3’ (SEQ ID N0.1),
(2)甲基化特异性下游引物(Reverseprimer)
5’ -Biotin- CAAAAA AACAAACAACCCCTCTAA -3’ (SEQ ID N0.2)；
(3)甲基化特异性测序引物(Sequencingprimer)
5’ - TTGGGGTAGAGATTAGT -3’ (SEQ ID N0.3)。
上述扩增的具体步骤为:
A.采用QIAGEN EpiTect*亚硫酸氢盐处理试剂盒(EpiTech BisulfiteKits; Qiagen; #59104)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。B.取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Pyromark PCR试剂盒(PyromarkPCR Kit; Qiagen; #978703)，并加入上述一对DRD4基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件:首先95°C 15min的变性；接着95°C 15s, Tm 30s, 72°C 20s，共50个循环的退火反应；然后延伸反应72°C 5min。(注:Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)
C.焦磷酸测序的前期准备:在PSQ96板中预先加入45μ I含有0.3μ M上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer;产品货号:Qiagen;#979009);将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3 μ I)转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer;产品货号:Qiagen;#979006)，使得平均每个样品约有50 μ I的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50 μ I反应体积)中，每样本50 μ I ;将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70%乙醇、洗涤缓冲液(PyroMark Wash Buffer;产品货号:Qiagen; #979008)和120ml的变性缓冲液(PyroMark Denaturation Solution; Qiagen;产品货号:#979007);打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具(PyroMark Vacuum PrepFilter Probes;产品货号:Qiagen; #979010)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作)；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70%乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5 — 10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入);使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应。
D.焦磷酸测序:在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上,采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)对步骤 C 中的 PSQ96 板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果示例见图2)。4、数据分析
本次研究采用SPSS 16.0对数据进行整理分析，我们发现:被检测的6个CpG位点中有5个位点(CpGU CpG2、CpG3、CpG4和CpG6)之间存在显著相关性(R>0.8，Ρ〈0.001，有统计学意义，见图1):(Ρ < 0.05时有统计学意义，下同)，因此我们把CpGl-CpG4，CpG6求平均值后，分性别比较了病例组与对照组间DRD4基因启动子区甲基化水平的差异，结果(见表I)发现CpG5以及CPG1-4，CPG6在男性中与精神分裂症存在关联(p < 0.05)。和其他技术相比，本发明设计的这种试剂盒可以从DRD4基因的甲基化程度的指标上，精确地对待测的样品进行精神分裂症的筛选。相比较一般采用的测量表，在定性上更具有说服力。同时，也可以通过甲基化程度的变化，可以初步判断病情的发病程度。更加有效、简便地对患者进行动态检测，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。表I分层后病例组与对照组间的比较(n=60)
权利要求
1.一种可用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因甲基化程度的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括一对DRD4基因启动子区甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:5’ - GTGAATTTAGGAGGTTGGGGTAGA _3’ ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:5’ -Biotin- CAAAAAAACAAACAACCCCTCTAA -3’ ； 所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID N0.3所示: 5，- TTGGGGTAGAGATTAGT -3'
2.一种如权利要求1所述的可用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于:在外周血检测中，该试剂盒可用于男性人群精神分裂症的辅助诊断、检测或筛查药物中。
全文摘要
本发明公开了可用于检测与精神分裂症相关的DRD4基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对DRD4基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQIDNO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对精神分裂症的检测，检测效率高，针对性强，同时，以DRD4基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为精神分裂症辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
文档编号C12Q1/68GK103103256SQ20121056045
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者周科娜, 段世伟, 戴东君, 郑荣炯, 章凯, 庄起东 申请人:宁波大学