控制植物穗粒数的gpa2基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了控制植物穗粒数的GPS2基因及其应用。该蛋白质为如下a）或b）所示：a）氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质；b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且控制水稻穗粒数的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明的蛋白及其编码基因与水稻穗粒数形成相关，能够用于水稻二次枝梗形成的分子机制研究，重演水稻驯化进程，对水稻高产品种的选育具有重要的理论及实际意义。
【专利说明】控制植物穗粒数的GPA2基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种控制植物穗粒数的GPA2基因及其应用。
【背景技术】
[0002]水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国一半以上的人口以稻米作为每日主食。因此，在当今中国人口不断增加、耕地面积日益减少的形势下，提高水稻单位面积产量成为满足人民温饱，保障国家粮食安全的有效手段。水稻的产量由三个要素组成:单位面积穗数、每穗粒数和千粒重。其中，每穗粒数由于在不同水稻品种中变异幅度最大，被认为是最具增长潜力的产量要素。
[0003]普通野生稻是栽培稻的直系祖先。自远古人类开始驯化普通野生稻以来，其在形态特征、生态特征、生理生化特性、适应性以及遗传多样性等方面在漫长的驯化和改良过程中发生了深刻的分化(Sun et al.，2001)。其中，最为重要的变化之一就是栽培稻较其野生祖先的高级枝梗数与穗粒数显著增加，最终使栽培稻单位面积产量大幅提升；但引起这一变化的分子机制尚不明确。因此，发掘和利用水稻近缘野生种基因组中控制穗粒数的基因，有助于解析水稻穗粒数形成的分子机制、探究水稻驯化进程，进而在理论上指导水稻高产育种实践。
[0004]云南元江普通野生稻是目前发现的海拔分布最高的普通野生稻；其分布点生态环境特殊，与栽培稻隔离好，是现今保存最完整的普通野生稻。与栽培稻相比，云南元江普通野生稻穗粒数和高级枝梗数明显减少，产量低。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种与水稻穗粒数相关的蛋白及其编码基因与应用。
[0006]本发明所提供的蛋白质，为如下a)或b)所示:
[0007]a)氨基酸序列如序列表中序列I所示的蛋白质；
[0008]b)将序列表中序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且控制水稻穗粒数的由序列I衍生的蛋白质。
[0009]上述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
[0010]本发明所提供的基因，具体是如下I)或2)或3)的DNA分子:
[0011]I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0012]2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码控制水稻穗粒数蛋白的DNA分子;
[0013]3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性及编码控制水稻穗粒数蛋白的DNA分子。
[0014]含有上述任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0015]本发明还提供了一种干扰上述基因表达的干扰RNA，其编码基因如序列表序列2自5’端第900至1026位核苷酸所示的DNA片段。
[0016]本发明还提供了表达上述RNA的载体，是在pTCK303/JL1460-GPA2的多克隆位点之间分别插入DNA片段A和DNA片段B得到的重组载体；所述DNA片段A为序列表的序列2自5’端第816至1026位核苷酸所示DNA的反向互补DNA ;所述DNA片段B为序列表的序列2自5’端第900至1113位核苷酸所示的DNA。
[0017]上述表达RNA的载体中，所述DNA片段A插入pTCK303/JL1460_GPA2的BamHI和KpnI酶切位点之间，所述DNA片段B插入pTCK303/JL1460_GPA2的SpeI和SacI酶切位点之间。
[0018]上述蛋白质、基因或权载体在调控植物穗粒数中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019]所述调控为增加植物穗粒数或减少穗粒数；所述植物为水稻。
[0020]本发明还具体提供了一种培育穗粒数增多的转基因水稻的方法。该方法是将出发水稻中上述蛋白的编码基因功能丧失，得到穗粒数增多的转基因水稻。
[0021]所述将基因功能丧失具体是将上述表达干扰RNA的载体导入所述出发水稻中。
[0022]实验证明，本发明的蛋白及其编码基因与水稻穗粒数形成相关，能够用于水稻二次枝梗形成的分子机制研究，重演水稻驯化进程，对水稻高产品种的选育具有重要的理论及实际意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为渗入系NIL92与轮回亲本特青的表型对比。A为主茎穗对比；B为一次枝梗长度对比。
[0024]图2，A为GPA2的图位克隆；B为候选基因结构示意图。
[0025]图3为抗生素阳性植株的PCR鉴定结果。泳道1，2为阳性转基因植株。
[0026]图4为GPA2转基因植株的表型鉴定图。A为穗部表型比较；B为整株表型比较；C为GPA2转基因植株与特青、NIL92的穗部性状比较。
【具体实施方式】
[0027]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]载体pTCK303/JL1460 在文献“(Wang Z, Chen CG, Xu YY, Jiang RX, Han Y, Xu ZHand Chong K.A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression inRice (Oryza sativa L ).Plant Molecular Biology Reporter，2004，22:409 - 417”中公开过，公众可以从中国农业大学获得。
[0030]云南兀江普通野生稻(Yuanjiang common wild rice)和特青(Teqing)在文献(Tan LBjLi XR, Liu FXj Sun XYjLi CGj Zhu ZFj Fu YCj Cai HWj Wang XKjXie DX andSun CQ.Control of a key transition from prostrate to erect growth in ricedomestication.Nature Genetics, 2008，40 (11): 1360-1364)中公开，公众可以从中国农业
大学获得。
[0031 ] 基因来源于云南元江普通野生稻。[0032]实施例1、控制穗粒数基因GPA2的发现
[0033]从利用云南元江普通野生稻为供体亲本，优良栽培稻品种特青为受体亲本构建的一套渗入系中发现其中一个渗入系NIL92,该渗入系在第2染色体长臂末端上含有来自云南元江普通野生稻的渗入片段，其二次枝梗数与穗粒数较轮回亲本特青明显下降。将渗入系NIL92和特青(图1)回交再自交构建的F2群体进行基因型和表型鉴定，在第2染色体长臂末端检测到一个与穗粒数相关的QTL，命名为q_GPA2，来自NIL92的等位基因相对特青的等位基因是完全显性的。利用上述群体构建了 GPA2区域的遗传连锁图谱，初步将目标QTL定位在两个标记RM5300和RM6312之间。接着利用一个包含4654个单株的分离群体，利用成对比较的方法对主茎穗粒数这一性状进行代换定位分析，最终将GPA2定位在标记RM3535和R4之间约32kb的区域，内含3个经过注释的候选基因(图2A)。经测序发现，其中一个候选基因LOC 0s02g56630 (图2B)上发现来自野生稻的等位基因上有一个1095bp的DNA片段插入，该插入使基因的表达模式完全发生了变化，形成了一个新的基因。RT-PCR的结果显示，该基因在NIL92中表达，而在特青中没有表达，符合该基因在NIL92的等位基因相对特青的等位基因是完全显性的表现型。通过5’ RACE和3’ RACE得到GPA2的全长基因组序列，有1378个碱基组成，该基因的编码框如序列2自5’末端起第3-290位核苷酸。该基因编码的蛋白的氣基酸序列如序列表的序列I所不，蛋白质命名为GPA2蛋白。
[0034]实施例2、GPA2转基因水稻的获得
[0035]一、干扰片段的构建
[0036]1、DNA片段A和DNA片段B的获得
[0037](I)设计引物
[0038]在引物两端分别引入限制性内切酶BamH 1、KpnI和Spe 1、SacI识别位点，引物序列如下: [0039]CRIl-F(正向):5’ CCGGATCCCTCCTCTGCATTGTCTTCAG-3，带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点；
[0040]CRI1-R(反向引物):5’ GGGGTACCATGGGATTTACGGTGATTGA-3，带下划线碱基为限制性内切酶KpnI识别位点；
[0041]CRI2-F:5’ TGACTAGTGCTACGCCACTGCATAAG-3，带下划线碱基为限制性内切酶 SpeI识别位点；
[0042]CRI2R: 5’ TAGAGCTCGTTACGGCCTTCTTCCAAAT-3’ 带下划线碱基为限制性内切酶 SacI识别位点；
[0043](2 ) DNA片段A和DNA片段B的获得
[0044]以NIL92的基因组DNA为模板，用CRIlF和CRIlR组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段A ;以NIL92的基因组DNA为模板，用CRI2F和CRI2R组成的引物对进行PCR扩增，得到 DNA 片段 B ;PCR 参数:先 94°C 5min ;随后 94°C 45sec，58°C 45sec，72°C lmin，共 33个循环；再72°C IOmin。
[0045](3)测序验证
[0046]将DNA片段A和DNA片段B分别测序验证。测序结果表明:DNA片段A，两端分别具有BamHI识别位点和KpnI识别位点，两个位点之间的序列为序列表的序列2自5’端第816至1026位的反向核苷酸所示的DNA ；DNA片段B，两端分别具有SpeI识别位点和SacI识别位点，两个位点之间为序列表的序列2自5’端第900至1113位核苷酸所示的DNA。
[0047]二、GPA2植物干涉载体的构建
[0048]1、BamHI 和 KpnI 酶切 DNA 片段 A ;
[0049]2、BamHI和KpnI酶切载体pTCK303/JL1460，回收载体骨架；
[0050]3、将步骤I的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组载体甲；
[0051]4、SpeI 和 SacI 酶切 DNA 片段 B ;
[0052]5、SpeI和SacI酶切重组载体甲，回收载体骨架；
[0053]6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到的重组载体即为GPA2的植物干涉载体 PTCK303/JL1460-GPA2。
[0054]测序验证结果表明:pTCK303/JL1460-GPA2的骨架载体为pTCK303/JL1460，在BamHI和KpnI酶切位点之间插入了序列2自5’端第816至1026位核苷酸所示的DNA的反向互补DNA、SpeI和SacI酶切位点之间插入了序列2自5’端第900至1113位核苷酸所示的 DNA。
[0055]三、转化水稻
[0056]将pTCK303/JL1460-GPA2用基因枪法转化NIL92的成熟胚愈伤组织，用含50mg/L潮霉素的NB培养基进行两轮筛选，每轮筛选20-30天，经预分化、分化得到阳性植株。将阳性植株进行PCR鉴定。PCR引物:5 ; -AM AGT TCG ACA GCG TCT CCG ACC-3 ; ；5 ; -TCT ACACAG CCA TCG GTC CAG ACG-3 ; ;PCR 反应条件:先 94°C 5min ;然后 94°C 30sec,58°C 30sec,72°C lmin，共31个循环；最后72°C IOmin0反应结束后，对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，转基因阳性植株可扩增出约IKb的条带。经PCR鉴定结合表型鉴定最终获得了 2个有表型变异的阳性Ttl代转基因植株。
[0057]同时以转入空载体PTCK303/JL1460的NIL92作为空载体对照。
[0058]四、转基因水稻的表型鉴定
[0059]将Ttl代转基因植株、T0代转空载体对照植株和NIL92以及特青进行表型鉴定后发现=Ttl代转基因植株在主茎穗粒数、二次枝梗数，二次枝梗粒数以及株高四个表型上较NIL92明显增加，但较特青为少，为部分恢复了特青的表型；在主茎穗长、一次枝梗粒数这3个农艺性状上恢复甚至超过了特青(图4)。表明本发明基因GPA2与水稻穗粒数相关，可用于研究水稻穗粒数形成的分子机理。
[0060]T0代转空载体对照植株与NIL92的表型无显著差异。
【权利要求】
1.一种蛋白质，为如下a)或b)所示: a)氨基酸序列如序列表中序列I所示的蛋白质； b)将序列表中序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且控制水稻穗粒数的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码控制水稻穗粒数蛋白的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性及编码控制水稻穗粒数蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种干扰RNA，其编码基因如序列表序列2自5’端第900至1026位核苷酸所示的DNA片段。
6.表达权利要求5所述RNA的载体，是在pTCK303/JL1460-GPA2的多克隆位点之间分另Ij插入DNA片段A和DNA片段B得到的 重组载体；所述DNA片段A为序列表的序列2自5’端第816至1026位核苷酸所示DNA的反向互补DNA ;所述DNA片段B为序列表的序列2自5’端第900至1113位核苷酸所示的DNA。
7.权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述基因或权利要求5或6所述载体在调控植物穗粒数中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于:所述调控为增加植物穗粒数或减少穗粒数；所述植物为水稻。
9.一种培育穗粒数增多的转基因水稻的方法，是将出发水稻中权利要求2或3所述基因功能丧失，得到穗粒数增多的转基因水稻。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于:所述将出发水稻中权利要求2或3所述基因功能丧失是将权利要求6所述载体导入所述出发水稻中。
【文档编号】C12N15/82GK103880936SQ201210560887
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】孙传清, 陈昊, 谭禄宾, 刘凤霞, 朱作峰, 付永彩, 才宏伟, 顾凭 申请人:中国农业大学